肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种全球范围内发病率和死亡率都很高的疾病,目前已成为威胁人类生命健康安全的恶性肿瘤,肝细胞癌的主要特点为疾病发展速度快、术后复发率高、癌细胞转移能力强,这给肝细胞癌的有效防治带来了巨大的困难,与化学合成单体药物相比较,传统植物药具有众多的优势,越来越多的植物药被发现具有抗肿瘤活性。因此,对植物药的研究是探索天然的抗肿瘤药物的重要途径。狭基线纹香茶菜Isodon lophanthoides var gerardianus(Benth)Hara 为唇形科多年生草本植物,其地上部分是广东传统中药溪黄草品种之一,为当前溪黄草的主流种植品种,具有利胆退黄、清热祛湿作用,为防治肝胆系统疾病的常用药,实验表明狭基线纹香茶菜的水提液具有良好的抗炎、抗肿瘤、保肝活性,其提取物的抗肿瘤活性研究较多,但其药效物质基础不清楚,我们研究团队前期筛选狭基线纹香茶菜水溶性成分的抗肿瘤活性,发现水溶性总黄酮部位能显著地抑制HepG2细胞活性,预实验结论也显示具有诱导细胞凋亡作用,有可能成为抗肿瘤候选药物,但药理研究基础薄弱,其机制也没有涉及。因此,研究其抑制HepG2细胞体内外活性及作用机制,对于深入开发应用溪黄草具有重要意义。本研究所用溪黄草药材为狭基线纹香茶菜。目的:本论文对溪黄草水溶性总黄酮的富集纯化方法进行了改良,研究溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌细胞HepG2生长抑制和诱导凋亡的作用及机制,通过建立荷瘤裸鼠动物模型,探讨研究溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌裸鼠移植瘤抑制作用及相关机制。方法:一、溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌细胞HepG2生长抑制作用采用细胞增殖抑制实验(MTT法)检测溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌细胞HepG2的生长抑制率。通过平皿集落形成试验观察溪黄草水溶性总黄酮对HepG2细胞贴壁生长并形成克隆的能力。流式细胞术检测水溶性总黄酮对HepG2细胞周期分布的影响。二、溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响通过检测细胞线粒体膜电位,细胞内ROS水平和流式细胞术分析水溶性总黄酮诱导HepG2细胞凋亡情况。三、溪黄草水溶性总黄酮诱导人肝癌细胞HepG2凋亡机制研究电镜检测细胞内自噬体情况,采用RT-PCR法检测溪黄草水溶性总黄酮对各组细胞Bcl-2mRNA、Bax mRNA、Survivin mRNA的基因表达变化、运用Western blot法检测各组的线粒体和胞质 cytochrome c,cytosolic AIF、Bcl-2、Bax、Survivin 蛋白表达,caspase-3蛋白表达。四、溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌裸鼠移植瘤抑制作用研究建立荷瘤裸鼠动物模型,给药后观察并测量裸鼠瘤体,计算体积大小,并绘出生长曲线。分离瘤体后,计算抑制率,病理组织学检查,检测外周血甲胎球蛋白变化,TUNEL染色检测各组移植瘤细胞凋亡。五、溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌裸鼠移植瘤抑制作用机制研究透射电镜观察瘤组织细胞的自噬小体和细胞超微结构,RT-PCR法检测基因Beclinl、Atg5、CyclinD1、Caspase-3、bax、bcl-2、Survivin、nm23-H1 和 MMP-9 mRNA的表达,Western blot 法检测指标:Beclinl、Atg5、CyclinD1、Caspase-3、bax、bcl-2、Survivin、nm23-H1 和 MMP-9 蛋白表达。结果:一、溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌细胞HepG2生长抑制作用MTT法结果显示,水溶性总黄酮对HepG2细胞增殖有明显的抑制作用,呈现浓度依赖性和一定的时间依赖关系。给药后显微镜下观察到细胞出现各期凋亡细胞形态,产生凋亡小体,提示可能与促进HepG2细胞凋亡有关。细胞平皿集落形成实验显示,水溶性总黄酮处理组的细胞集落形成数明显少于溶媒对照组。提示可能与抑制细胞锚定依赖性生长作用有关。细胞周期实验结果显示,总黄酮各浓度组G0/G1期细胞比例均明显高于对照组,而S期细胞比例均明显低于对照组,这说明水溶性总黄酮能有效地将HepG2细胞阻滞于G0/G1期,进而抑制细胞增殖和生长,呈现剂量依赖性。二、溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响流式细胞术分析结果显示,水溶性总黄酮各浓度组和各时间点的凋亡率均明显高于对照组,呈剂量和时间依赖关系。细胞线粒体膜电位实验显示,水溶性总黄酮和5-FU均能诱导HepG2细胞线粒体膜电位去极化。检测细胞内ROS水平,结果显示,水溶性总黄酮能诱导HepG2细胞内ROS升高。这些提示水溶性总黄酮能通过干扰细胞线粒体膜电位,升高细胞内ROS水平,诱导HepG2细胞凋亡。三、溪黄草水溶性总黄酮诱导人肝癌细胞HepG2凋亡机制研究透射电镜下观察,水溶性总黄酮具有抑制细胞自噬作用;RT-PCR法检测结果显示,抗凋亡蛋白基因bcl-2 mRNA和Survivin mRNA随着水溶性总黄酮浓度升高而减少,呈浓度依赖关系,相反,促凋亡蛋白基因BaxmRNA和Caspase-3mRNA随着药物浓度升高而增加,也呈浓度依赖关系。Western blot法分析结果也进一步证实水溶性总黄酮是通过下调抗凋亡蛋白(bcl-2 and mcl-1)和survivin和上调促凋亡蛋白(Bax)的表达水平诱导HepG2细胞凋亡。WB分析还发现,水溶性总黄酮还增高线粒体膜通透性,向胞质内释放促凋亡因子Cytochrome c和Cytosolic AIF,引起细胞凋亡。四、溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌裸鼠移植瘤抑制作用研究各组连续给药21天,绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率,与模型组相比,水溶性总黄酮高、中剂量药物组和5-FU组均能抑制肿瘤的生长,呈剂量相关性,其中以药物高剂量组、5-FU组和水溶性总黄酮高剂量+5-FU组效果最佳。各给药组与模型组比较,均能显著地降低AFP。而各给药组的肿瘤/体重比结果显示,水溶性总黄酮高剂量+5-FU组动物的基本情况明显好转,说明水溶性总黄酮和5-FU联合应用既抑制了肿瘤生长,又克服了化药的副作用,改善了生活质量。病理组织学检查发现,水溶性总黄酮各组的瘤体中肿瘤细胞发生凋亡,有中度坏死灶,这表明水溶性总黄酮对癌细胞具有促进凋亡、抑制分裂增殖的作用。荷瘤裸鼠胸腹腔未见积液,心、肝、肾、脾、肺、脑等脏器未见癌细胞转移结节及其他异常。Tunel染色发现,水溶性总黄酮组随着浓度的增大凋亡细胞数量增加,显示出一定的量效关系。五、溪黄草水溶性总黄酮对人肝癌裸鼠移植瘤抑制作用机制研究电镜观察水溶性总黄酮抑制肝癌细胞形成自噬体,这与细胞实验中的结论相一致。细胞超微结构也出现了明显的形态学改变和大量的凋亡小体。RT-PCR法检测表明水溶性总黄酮是通过下调抗凋亡蛋白基因bcl-2 mRNA和survivinmRNA和上调促凋亡蛋白Bax mRNA和Caspase-3 mRNA的表达水平诱导移植瘤HepG2细胞凋亡。水溶性总黄酮能抑制自噬基因Beclin1mRNA、Atg5mRNA的表达,能抑制CyclinD1 mRNA、MMP-9mRNA基因的表达,且呈现浓度越高越明显的浓度依赖关系,相反,水溶性总黄酮能促进nm23-H1基因的表达,浓度越高越明显。Western blot法分析结果也进一步证实水溶性总黄酮是通过下调抗凋亡蛋白基因bcl-2和Survivin和上调促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达水平诱导移植瘤HepG2细胞凋亡。水溶性总黄酮还能抑制Beclin1、Atg5、CyclinD1、MMP-9等蛋白的表达,相反,水溶性总黄酮能促进nm23-H1蛋白的表达,结论:本研究以溪黄草水溶性总黄酮为研究对象,应用了多种方法研究了其体内外抑制HepG2细胞的活性及其机制。在体外,水溶性总黄酮有效地将HepG2细胞阻滞于G0/G1期,干扰细胞线粒体膜电位,升高细胞内ROS水平,诱导HepG2细胞凋亡。其机制可能是通过下调抗凋亡蛋白(bcl-2 and mcl-1)和survivin和上调促凋亡蛋白(Bax)的表达水平,促使细胞色素C向胞质内释放,诱导HepG2细胞凋亡,抑制细胞增殖。在体内,水溶性总黄酮能抑制裸鼠移植瘤的生长。其可能机制一方面通过抑制自噬,阻止肿瘤细胞从周围的基质细胞中获取能量和营养物质,从而抑制肿瘤细胞生长,另一方面,通过下调抗凋亡蛋白基因bcl-2和Survivin和上调促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达水平诱导移植瘤HepG2细胞凋亡,并通过有效地抑制HepG2细胞体内侵袭和转移能力抑制肿瘤生长。这些研究为溪黄草临床应用及进一步开发应用提供了可靠的理论依据。