论文部分内容阅读
目的: 本实验通过建立雄性昆明小鼠H22肝癌移植瘤动物模型，采用MTT法、Transwell技术、ELISA法及免疫组织化学法等，检测脾脏淋巴细胞活性，肿瘤组织中IFN-γ、IL-6及TGF-β的水平，并观察H22肝癌移植瘤中Caspase-9、Caspase-3、MST1和γ-H2AX的表达，探讨山仙颗粒对H22肝癌移植瘤肿瘤微环境淋巴细胞活性及肿瘤细胞凋亡的影响，为此药物在临床的推广使用提供可靠的理论依据。 方法: （1）瘤细胞悬液的制备：将1ml低温冻存的H22细胞快速溶解后，调制成1×107个/ml细胞悬液，并接种于2只昆明小鼠腹腔内，每只0.1ml（约1×106个瘤细胞），常规饲养一周后，抽取腹水，并调制成1×107个/ml瘤细胞悬液。 （2）昆明小鼠H22肝癌移植瘤模型的建立：选取健康雄性的昆明小鼠共50只，体重约18～22g。随机选择40只（其余10只做为空白组），将制备好的H22瘤细胞混悬液0.1ml（约1×106个瘤细胞）接种于小鼠右前肢腋窝皮下，编号，并随机分为4组：模型组及山仙颗粒大、中、小剂量组。 （3）山仙颗粒药液配制:山仙颗粒(g)与生理盐水(mL)的比例分别为：1∶10、1∶20及1∶40,即配成0.1g/ml、0.05g/ml及0.025g/ml大、中、小剂量的山仙颗粒混悬液,并贮存于4℃冰箱中，备用。 （4）实验小鼠灌胃:根据人、动物体重计量换算法计算，大剂量组：2g/kg/d、中剂量组：1g/kg/d、小剂量组：0.5g/kg/d，分别相当于临床上等效剂量的4、2、1倍。经换算后分别用大、中、小剂量三种浓度的山仙颗粒混悬液0.4ml于上、下午8:00各灌胃一次；模型组、空白对照组分别以0.4m l生理盐水灌胃；每日2次，连续30天。 （5）样品采集:于开始灌胃的第30天（末次给药后24小时），将小鼠称重，颈椎脱臼法处死，剥离瘤组织，游离脾脏，称重并记录。 （6）MTT法及Transwell技术检测淋巴细胞毒效应：制备小鼠脾脏淋巴细胞悬液（即效应细胞），将细胞浓度调整为1×107个/ml；制备瘤细胞悬液（即靶细胞），并将细胞浓度调整为1×106个/ml。将淋巴细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔中的量按照不同的浓度梯度比进行（效应细胞与靶细胞比例分别为10∶1、20∶1、40∶1），每组设3个复孔。在每孔中加入小室进行隔离室内外溶液，在每个小室内加入20μl的瘤细胞，放入培养箱共培养24h，用MTT法测出靶细胞的OD值。 （7）ELISA法检测瘤组织内相关细胞因子：取每组小鼠1/4瘤组织，PBS洗涤，加入相应比例的PBS，冰水中匀浆、离心、取上清，按照试剂盒标准检测各组小鼠瘤组织中IFN-γ、IL-6及TGF-β的表达。 （8）免疫组织化学法染色：10%的中性福尔马林固定瘤组织，常规脱水处理，石蜡包埋，将组织连续切片为4～6μm，脱蜡至水，免疫组化染色，光镜下观察瘤组织中Caspase-9、Caspase-3、MST1和γ-H2AX的表达情况。 结果: （1）抑瘤率：山仙颗粒大、中、小剂量组对H22肝癌的抑瘤率分别为41.246%、26.801%、19.835%，抑瘤率与用药剂量呈正相关，且结果具有统计学意义（P＜0.01）； （2）脾脏指数：模型组脾脏指数明显低于空白组小鼠脾脏指数（P＜0.01），山仙颗粒大、中、小剂量组小鼠脾脏指数明显高于模型组（P＜0.01），且小鼠脾脏指数与山仙颗粒用药剂量呈正相关，差异具有统计学意义； （3）抑制率：模型组与空白组相比较具有显著差异（P＜0.01）；山仙颗粒大、中、小剂量组与模型组比较有显著差异（P＜0.01）；同组不同浓度效靶比之间比较有显著差异（P＜0.01），且效应细胞对靶细胞的杀伤作用与山仙颗粒用药剂量呈正相关，结果具有显著的统计学意义； （4）肿瘤组织中IFN-γ、IL-6及TGF-β的含量：模型组与空白组比较IFN-γ、IL-6、TGF-β的含量均有显著差异（P＜0.01）；山仙颗粒各组与模型组比较有显著差异（P＜0.01）；山仙颗粒可上调瘤组织内IFN-γ的含量，下调IL-6、TGF-β的含量； （5）H22肝癌移植瘤组织中Caspase-9、Caspase-3、MST1及γ-H2AX的表达：山仙颗粒大、中、小剂量组与模型组比较Caspase-9、Caspase-3、MST1及γ-H2AX的表达均具有显著差异（P＜0.01），且表达量与药物剂量呈正相关。 结论: （1）山仙颗粒对H22肝癌移植瘤细胞具有抑制作用，且作用与药物剂量呈正相关。 （2）山仙颗粒可提高淋巴细胞的杀伤作用，且淋巴细胞活性与药物剂量呈正相关。 （3）山仙颗粒可上调瘤组织内IFN-γ的含量，下调IL-6、TGF-β的含量； （4）山仙颗粒可以促进H22肿瘤组织中Caspase-9、Caspase-3、MST1和γ-H2AX的表达，且表达水平与药物剂量呈正相关； （5）山仙颗粒可抑制小鼠H22肝癌移植瘤细胞的增殖，其机制可能与其调节肿瘤微环境中相关细胞因子含量及诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。