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目的金黄色葡萄球菌是一种重要的人类致病菌，能够引起皮肤和软组织感染，脓毒血症，中毒性休克和坏死性肺炎等一系列中度或重度感染性疾病。近些年来，由于耐药菌株的出现，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的快速播散，以及耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistantMRSA strains，VRSA)，甚至是多重耐药MRSA的不断检出，使临床上可用于治疗金黄色葡萄球菌感染的抗菌药物屈指可数。同时MRSA有形成生物膜的能力，从而阻碍抗生素发挥抗菌作用，这又进一步加剧了抗MRSA感染治疗的难度。而MRSA感染的死亡率要远远高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible S.aureus,MSSA)感染的死亡率,这些迫使我们必须探索新的抗MRSA策略。近年来，阻断群体感受系统(Quorum sensing，QS)能够有效降低细菌的致病力、减小生存压力和不易诱发耐药，因而成为倍受青睐的抗菌新策略之一。本研究的目的是利用反义技术抑制金黄色葡萄球菌agr群体感受系统中的关键分子agrA的表达，阻断agr信号通路，从而降低金黄色葡萄球菌的致病力，为抗MRSA感染提供一个潜在的靶点和一种新思路。方法1.针对agrA mRNA反义寡核苷酸的设计合成：在NCBI的Nucleotide数据库中检索agrA mRNA的序列，并利用BLAST工具比对agrA在不同葡萄球菌菌属中的同源性。首先应用Primer Premier5.0软件，预测与agrA mRNA特异结合的反义寡核苷酸序列(18～24bp)；然后再用RNAstructure4.5软件预测agrA的mRNA的二级结构并计算反义寡核苷酸与agrA mRNA各靶点结合时的自由能；最后，综合PrimerPremier5.0和RNA structure4.5分析结果选取参数较优的反义寡核苷酸，进行锁核酸修饰，并与透膜肽(KFF)3K共价连接，制备成与透膜肽偶联的锁核酸(Cell penetratepeptide conjugated locked neucleic acid, PLNA)。2.抗agrA反义锁核酸PLNA34和PLNA522对MRSA生长的影响：以社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)菌株LAC(USA300)作为实验菌株，通过观察细菌的生长曲线对筛选的两条PLNA(PLNA34和PLNA522)的抗菌活性进行评价。实验中PLNA34和PLNA522的药物终浓度分别为12.5μM，25μM和40μM，同时设PBS为空白对照组。3.抗agrA反义锁核酸PLNA34和PLNA522降低MRSA毒力基因表达的研究：将LAC菌液与PLNA34和PLNA522共孵育，5h后收集菌体和上清。利用荧光定量PCR检测PLNA对agrA及受其调控的毒力因子psmα和psmβ表达的抑制作用，和agr的效应分子RNAⅢ及其调控的毒力基因hla和pvl表达的抑制作用；利用westernblot检测PLNA对hla编码的α-溶血素的抑制效果；利用溶血试验检测细菌培养上清中溶血素的分泌情况；通过人中性粒细胞裂解和趋化实验分析细菌培养上清中PSMs的分泌情况。实验中PLNA34和PLNA522的药物终浓度分别为3.125μM，6.25μM和12.5μM，同时设PBS为空白对照组。4.抗agrA反义锁核酸PLNA34的体内活性研究：构建C57BL/6J小鼠皮下感染模型，将PLNA34与细菌菌液混合后立即注射到小鼠皮下，观察PLN34对C57BL/6J小鼠脓肿创面大小的影响；通过测定C57BL/6J小鼠皮下脓肿中细菌CFU，观察PLNA34对机体清除细菌的促进作用；通过C57BL/6J小鼠皮下脓肿的HE染色，观察PLNA34对小鼠皮肤组织的病理保护作用。PLNA34的药物终浓度为40μM，PBS作为空白对照组。结果1.针对agrA mRNA反义寡核苷酸的设计合成：Nucleotide数据库中提供的金黄色葡萄球菌agrA的序列就是其mRNA序列；BLAST结果显示agrA在金黄色葡萄球菌中的同源性很高，甚至与某些表皮葡萄球菌的相似度也达到80%，表明agrA可作为特异性的反义靶点。结合Primer Premier5.0和RNAstructure4.5分析结果优选取2条潜在的反义寡核苷酸序列，进行锁核酸修饰后与透膜肽(KFF)3K共价连接，分别为PLNA34和PLNA522。2.抗agrA反义锁核酸对MRSA生长的影响：PLNA34组，PLNA522组和PBS对照组在各个时间点的吸光值基本一致，绘制的生长曲线也几乎完全重合，说明PLNA34和PLNA522不影响LAC的生长，体外无抗菌活性，这与设计理论相符。3.抗agrA反义锁核酸PLNA34和PLNA522降低MRSA毒力基因表达：荧光定量PCR结果显示，与PBS空白对照组相比，在药物浓度均为12.5μM时PLNA34和PLNA522都能够显著抑制靶基因agrA mRNA (P<0.001)和agr效应分子RNAⅢ(P<0.001)的表达，同时能明显抑制被RNAⅢ调控的毒力基因hla (P均<0.001)和pvl (P均<0.001)，也显著下调受AgrA调控的重要毒力基因psmα(P均<0.001)和psmβ的表达(PLNA34,P<0.001；PLNA522，P<0.01)。但在相同浓度(均为12.5μM)时， PLNA34比PLNA522能更有效地抑制上述6个基因的转录(P<0.001)，且具有剂量依赖效应。Western blot结果显示，PLNA34组α-溶血素蛋白的表达受到了明显的抑制且呈剂量依赖性，12.5μM PLNA34组细菌几乎未表达α-溶血素，而PLNA522组α-溶血素蛋白的表达仅受到了轻度的抑制。溶血试验表明，PLNA522组与PBS空白对照组相比无显著性差异，不同浓度的PLNA34均能显著降低溶血率(P<0.01)且具有剂量依赖性。相同浓度(均为12.5μM)作用下， PLNA34组较PLNA522组能有效降低溶血率(P<0.01)。中性粒细胞裂解和趋化实验表明，PLNA522组与PBS空白对照组相比无显著性差异，6.25μM和12.5μM PLNA34组显著降低细胞的裂解程度(P<0.05)，不同浓度PLNA34组显著降低细胞的趋化程度(3.125μM组与6.25μM组，P<0.01；12.5μM组，P<0.001)。以上结果初步说明PLNA34的反义抑制效果优于PLNA522。4.抗agrA反义锁核酸PLNA34的体内活性研究：在C57BL/6J小鼠皮下感染模型中，PLNA34能够显著减小感染伤口的大小，抑制脓肿的形成；能够明显降低感染部位的细菌滴度(P<0.001)；减轻LAC对皮肤组织的损伤。结论1．抗agrA mRNA的PLNA34和PLNA522能够选择性抑制LAC agrA的表达，但PLNA34的抑制效果更好，能有效地降低细菌毒力，促进机体对体内细菌的清除。2．AgrA可作为抗MRSA感染的新靶点，通过抑制关键分子AgrA的表达或使其失活从而阻断agr群体感受系统，为抗MRSA提供新策略。