胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,占全部颅内肿瘤的40％～50％,其中恶性胶质瘤占脑胶质瘤的60％。目前对于脑胶质瘤的治疗多为临床手术,辅以术后的放疗、化疗。但脑胶质瘤细胞虽不向远处转移,却向正常脑组织浸润性生长,与正常组织分界不清,故此手术很难完全切除。残存的肿瘤细胞会造成术后肿瘤再次复发,从而严重影响患者的生存质量和生存期。据统计目前恶性胶质瘤患者中位生存期仅为9～12个月。虽然术后的放疗、化疗可以有效地杀伤部分残存的肿瘤细胞,但同时亦会损伤正常脑组织,并会出现严重的全身不良反应,治疗效果不甚满意。因此,积极探索有效地治疗方法,寻求更佳的治疗方案及有效地控制术后脑胶质瘤的复发将成为提高脑胶质瘤治疗效果的关键。　　 光动力学疗法(PDT)是一种新兴的治疗方法,其原理是利用光敏剂可特异性的聚集于肿瘤组织内并可被特定波长的光所激活,从而产生一系列有细胞毒性的活性分子,直接诱导肿瘤细胞坏死和凋亡,从而达到治疗的目的。目前光动力学疗法已在多种肿瘤的实验研究与临床治疗当中应用,这些实验和探索已初步表明PDT是一种有效的肿瘤局部治疗手段。　　 目前,关于PDT治疗脑瘤的相关报道并不多见,初步的临床应用表明PDT治疗恶性脑胶质瘤,可使肿瘤组织发生坏死,从而延长恶性胶质瘤患者的生存时间,但多数患者最终还会因肿瘤复发而死亡。在动物实验的研究水平上,迄今为止,有关PDT治疗脑胶质瘤的研究多数是探讨PDT治疗后肿瘤及周围脑组织的急性反应(一般是在治疗后的3天之内),在此期间,PDT可使肿瘤组织发生坏死和细胞凋亡。但PDT对胶质瘤和正常脑组织的影响远不止于此,在PDT治疗后的亚急性期,肿瘤及周围脑组织会出现何种反应,对此人们对却知之甚少,因此在评价PDT在脑胶质瘤中的治疗作用方面还有一些不足。　　 本研究通过建立9L/Fischer344大鼠原位脑胶质瘤模型,利用新型的光敏剂5-氨基乙酰丙酸(ALA),观察ALA-PDT的治疗效果并探讨其治病机理;另外,我们还将研究在PDT照射后的亚急性期,胶质瘤和正常脑组织对PDT的反应,为正确的评价PDT在脑胶质瘤中的治疗作用提供完整的理论依据;本研究还将积极探究有效地脑胶质瘤治疗方案,即利用显微外科手术辅以术后ALA-PDT疗法治疗大鼠脑胶质瘤,观察其作用效果,并就其作用机理进行深入探讨,从而为临床提供有效地治疗方案,并提供实验、理论依据。本课题共分三部分进行:　　 第一部分采用立体定向技术,在Fischer344大鼠右侧额叶尾状核接种经体外培养、定量的9L细胞。接种后动态观察大鼠生存状态及生存时间;利用H.E.染色法定期观测颅内肿瘤的生长情况及病理形态学特点;待动物死亡后,解剖取脑,制作病理切片,再次观察肿瘤的大小及组织的形态变化。另外,在建立大鼠9L脑膜瘤的基础上,应用神经外科显微技术近全切除大鼠颅内胶质瘤,建立了9L大鼠恶性脑胶质瘤显微切除模型。并观察术后大鼠的生存状态及生存时间;观测颅内肿瘤的生长情况及形态学特点;待动物死亡后,再次观察肿瘤的大小及组织的形态变化。而且通过免疫荧光双标法检测神经胶质酸性蛋白(GFAP)和中间丝蛋白(Vimentin)在脑胶质瘤及切除后复发肿瘤组织中的表达情况。通过上述两个模型的建立,为后续的肿瘤实验治疗研究提供可靠的动物实验平台。　　 第二部分利用新型的光敏剂5-氨基乙酰丙酸(ALA),观察新的PDT治疗手段(ALA-PDT)在PDT照射后的亚急性期的治疗效果及探讨其作用效果。32只大鼠颅内种植9L胶质瘤细胞。24只接受PDT治疗的荷瘤大鼠在种植后第7天,接受PDT治疗前3h腹腔注射300 mg/kg的光敏剂ALA,并在24小时后分别以40 J/cm2(8只),80 J/cm2(8只)和120 J/cm(只)的不同激光剂量进行治疗。其余8只大鼠作为对照组。观察大鼠的一般生存状态;在肿瘤植入14天后,通过H.E.染色法检测颅内肿瘤的生长情况,在对其作用机理的探讨中,利用免疫组化法检测肿瘤细胞的增殖活性(Ki67)和TUNEL法测定肿瘤细胞的凋亡;另外本部分实验还将重点研究在PDT照射后的亚急性期,胶质瘤和周围相对正常的脑组织的反应,利用Westernblot的方法分别检测肿瘤区和肿瘤邻近区域中血管内皮生长因子(VEGF)及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达情况。　　 第三部分重点观察显微外科近全切除手术联合ALA-PDT治疗大鼠原位9L脑胶质瘤的效果并对其作用机理进行探讨。32只大鼠颅内种植9L脑胶质瘤细胞7天后,随机分为对照组(未治疗)、手术组(近全切除颅内肿瘤)、PDT组(ALA:300 mg/kg,能量密度:80 J/cm2)和联合治疗组(手术切除+PDT),并给予相应治疗。治疗后7天取出脑组织,利用H.E.染色检测肿瘤体积及浸润瘤灶的情况,并分别通过免疫组化法和TUNEL染色法分析胶质瘤细胞的增殖和凋亡的情况。　　 结果:第一部分通过立体定向接种体外培养细胞的技术成功建立了大鼠颅内9L胶质瘤模型。大鼠接种后的初期无明显不良反应,随着肿瘤的生长而逐渐出现相应的表现,其过程符合临床脑胶质瘤的发展过程。H.E.染色和免疫组化结果显示9L细胞所引起的脑胶质瘤具有该肿瘤的病理形态学和生物学特点,并可在肿瘤周围引起胶质细胞的反应,免疫荧光双标法检测显示脑胶质瘤细胞强表达特异性的蛋白Vimentin,周围反应性的胶质细胞表达GFAP。另外利用显微外科技术成功建立了近全切除脑胶质瘤手术切除模型。手术切除后在一段时期内可提高大鼠的生存状态,延长生存时间,但最终会因肿瘤复发而死亡。复发以后的肿瘤无论是在形态学还是在生物学方面都未发生明显变化。　　 第二部分利用新的光敏剂ALA,建立了新的PDT治疗模式-ALA-PDT。不同剂量的ALA-PDT治疗后明显改善由于脑胶质瘤所引起的大鼠生存状态的下降,并且减小脑胶质瘤的体积,其治疗效果在一定范围内随着剂量的增大而增强,但80和120J/cm2的治疗效果基本相同。通过对肿瘤细胞增殖和凋亡的检测发现,ALA-PDT的治疗作用是通过诱导肿瘤细胞的凋亡而实现的,对细胞的增殖没有影响,因此残存的处于增殖期的肿瘤细胞仍可成为治疗后肿瘤复发的原因。另外在照射后的亚急性期,通过Westerb blot方法发现对照组及不同剂量的ALA-PDT组中肿瘤组织内的HIF-1α和VEGF的表达均很高,在肿瘤旁组织中,对照组的HIF-1α和VEGF略有表达,随着ALA-PDT治疗剂量的疗增高,HIF-1α和VEGF的表达也逐渐增高,有以120J/cm2的照射剂量作用最为显著。　　 第三部分与对照组相比,手术切除组、单独ALA-PDT组和联合治疗组在治疗7天后均可明显缩小脑瘤体积(P＜0.01)。在3个治疗组中,以联合治疗组的治疗效果最佳,脑瘤体积比PDT组和手术组分别减少约82％(P＜0.001)和54％(P＜0.01)。光镜下观察H.E.切片发现,对照组和PDT组肿瘤体积大,无出血和坏死,肿瘤呈浸润性生长,周围有大量的大小不一的浸润灶。手术组和联合治疗组中的肿瘤绝大部分被切除,术后“残腔”周围有少量的肿瘤浸润灶,但联合治疗组中的浸润灶为边界清楚的小圆形病灶,且数量极少,浸润瘤灶面积也最小。另外,3只联合治疗组的大鼠和2只手术组的大鼠在术后“残腔”周围有少量出血灶。TUNEL染色显示手术组的阳性细胞和对照组相比无显著性差异,但ALA-PDT组和联合治疗组的阳性细胞数却明显高于对照组,说明手术切除对肿瘤细胞的凋亡无影响,但ALA-PDT和联合治疗却可以明显的促进肿瘤细胞的凋亡。Ki67免疫组化染色表明Ki67指数在各组间比较无显著性差异。　　 结论:19L/Fischer344大鼠原位脑胶质瘤模型良好地模拟了人颅内脑胶质瘤的发展过程,具备该肿瘤的形态学及生物学特性,模型成功。　　 2运用显微外科技术近全切除脑胶质瘤可改善荷瘤大鼠的生存状态,延长生存时间,但肿瘤仍可复发。　　 3 ALA-PDT可通过诱导肿瘤细胞的凋亡来减少脑胶质瘤的体积,且无明显不良反应。但ALA-PDT在治疗的同时可促进肿瘤旁组织中的HIF-1α和VEGF的表达增高,从而促进肿瘤的复发,影响治疗效果。　　 4近全手术切除颅内肿瘤并联合ALA-PDT治疗明显提高了脑胶质瘤的治疗效果,这与ALA-PDT促进手术后残存肿瘤细胞的凋亡,杀灭浸润的肿瘤病灶有关,因此该联合治疗方案有可能成为临床治疗脑胶质瘤的新途径。