论文部分内容阅读
瑞香狼毒（Stellera chamaejasme Linn.）是瑞香科狼毒属多年生草本植物,全草有毒,主要毒性成分为狼毒素,家畜大量采食后会导致中毒甚至死亡。瑞香狼毒作为药用植物始载于《神农本草经》,在《中华本草》等众多药典中均有记载。藏传医药经典丛书《四部医典》和《如意宝树》中记载瑞香狼毒有外敷消肿、治各种顽癣和疖疮,内服治疠病、炎症和水肿臌胀的特效。现代研究也表明瑞香狼毒中多种活性成分具有抑菌、抗病毒和抗肿瘤等活性。目前关于瑞香狼毒的研究主要集中在化学成分分离鉴定和活性成分分析等方面,而对其在自然生境中的生长习性及生理特性等基础研究甚少。与其他草地植物相比,瑞香狼毒更能适应高盐、干旱和冷等恶劣环境。近年来,瑞香狼毒的快速扩张,给草原生物多样性造成了极大威胁,也给当地畜牧业的发展造成了巨大损失。本研究以瑞香狼毒为研究对象,通过对其在自然生境中的生理和光合特性的研究,了解瑞香狼毒的基本生存特性;利用第二代高通量测序技术建立瑞香狼毒响应盐胁迫的遗传信息数据库,在此基础上,采用生物信息学、分子生物学及生理生化等手段在生理和分子水平上深度解析瑞香狼毒的盐胁迫响应机制,为瑞香狼毒的有效防控和作为药用植物的可持续开发利用提供理论依据。主要研究结果如下:（1）以自然生境中盛花期的瑞香狼毒为研究对象,采用便携式光合仪LI-6400XT测定其日光合曲线,结果表明:盛花期瑞香狼毒净光合速率曲线呈双峰,存在午休现象。不同数学模型对光响应曲线进行拟合的结果表明直角双曲线修正模型的R2更高,且能拟合高光强产生光抑制的部分数据,因此更为合适。瑞香狼毒的光合特性、叶绿素荧光特性、生理生化指标和叶绿体色素含量均在盛花期后的不同阶段开始逐渐下降。（2）利用HiSeq 4000测序平台对300 mM NaCl胁迫处理0 h、3 h、12 h、24 h和72 h的15个瑞香狼毒在样本进行测序,共获得115.74 GB clean data。经Trinity软件拼接组装后共获得121781个unigenes,其中有64561（53.01%）个注释到不同的数据库中。物种相似性比对结果表明与瑞香狼毒亲缘关系较近的5个物种分别是可可（Theobroma cacao）、木本棉（Gossypium arboreum）、葡萄（Vitis vinifera）、甜橙（Citrus sinensis）和麻风树（Jatropha curcas）。基因表达分析共产生了5888个差异表达基因。这些差异表达基因主要富集在响应盐胁迫、响应光刺激、激素介导的信号转导、响应Ca2+等GO功能的生物学过程中。KEGG富集结果表明:萜类化学物的合成、植物激素信号转导和玉米素生物合成可能在瑞香狼毒的盐胁迫响应过程中发挥重要作用。（3）以转录组测序获得的fasta序列为原始文件建立瑞香狼毒本地转录组数据库,采用blast程序比对筛选出18S、60S、CYP、GAPCP1、GAPDH2、EF1B、MDH、SAND、TUA1和TUA6等10个用于基因表达标准化分析的候选内参基因,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个程序对它们在3种非生物胁迫（干旱、冷和盐）和3种激素处理（ABA、GA和ETH）下作为内参基因的稳定性进行评估。结果表明:GAPCP1和EF1B被认为是3种非生物胁迫下的最佳内参基因组合;TUA6和SAND,TUA1和CYP,GAPDH2和60S分别是ABA,GA和ETH处理的最稳定内参组合;GAPCP1和60S被评估为所有处理的最佳内参基因组合,而18S则在所有胁迫处理中表达最不稳定。选择最稳定内参基因组合、最稳定内参基因和最不稳定内参基因对两个靶基因（P5CS2和GI）进行标准化的结果进一步验证我们选择的内参基因适用于基因表达标准化。此外,以GAPCP1和EF1B作为内参基因,对盐胁迫下的差异表达基因中随机挑选的6条unigenes进行标准化,其结果与转录组测序结果完全一致,证明测序结果的可靠性。（4）以盐胁迫下15个瑞香狼毒样本转录组数据分析获得的差异表达基因的表达值为原始数据,采用加权基因共表达网络分析对瑞香狼毒参与盐胁迫响应的潜在调控基因和信号途径进行了深度分析。结果表明:加权基因共表达网络分析将5888个差异表达基因中的2803个分为6个模块。在每个模块中,通过权重系数鉴定具有最高连通性的前5个基因,并且通过基因本体注释筛选出直接参与盐胁迫响应的27个基因。为探讨模块在瑞香狼毒响应盐胁迫中的作用,选取蓝色模块中的核心基因ScGH3.1来做进一步功能分析。结果表明ScGH3.1过表达显著增强了拟南芥的盐胁迫耐受性,推测蓝色模块可能在瑞香狼毒的盐胁迫响应中发挥正调控作用。（5）从瑞香狼毒中首次克隆到瑞香狼毒利钠肽A基因（ScPNP-A）,此基因为double-psi beta-barrel（DPBB）fold超家族中的一个成员,为包含DPBB1结构域的蛋白。烟草叶片下表皮的亚细胞定位结果表明ScPNP-A定位于细胞间隙,是一种分泌蛋白。在瑞香狼毒中,ScPNP-A的表达受到盐、干旱和冷胁迫的显著上调。生理生化和抗性相关基因的表达结果表明ScPNP-A过表达可显著提高拟南芥的盐、干旱和冰冻耐受性。此外,ScPNP-A可通过增强机体的系统获得性抗性增强对病原菌的抵抗力。这些结果表明,ScPNP-A可作为一个正调控因子在植物应对非生物胁迫和生物胁迫中发挥积极作用。