中医外治经典著作《理瀹骈文》(清·吴师机)记载：“膏中用药味,必得通经走络,开窍透骨,拨病外出之品为引。如姜、葱、韭、蒜、白芥子、花椒及蓖麻子……”,又有“虑其或缓或无力也,假猛药、生药、香药,率领群药,开结行滞,直达其所……”的论述。这些论述体现了中药外用制剂的组方特点,即重用“气味俱厚”的药味,并明确指出“生药、猛药、香药”(含挥发性成分,有效部位多为挥发油)可以“率领群药,直达病所”,可见,中药外治处方中该类药味具有类似现代经皮给药系统的促透剂作用。因此,本论文选择中药外用制剂中常用具该类功效药味花椒和薄荷为代表,研究其有效部位挥发油对不同logP值中药有效成分的经皮促透作用特征及其作用机制,分析挥发油对中药复杂成分的经皮促透规律及其作用机理。采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定花椒、薄荷挥发油的化学成分组成,采用紫外分光光度计、电导率仪等测定挥发油相关物化性质参数,采用气相色谱建立不同提取批次挥发油的气相指纹图谱,验证其不同提取批次间的质量稳定性；选择表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)及真皮成纤维细胞(CCC-ESF-1细胞)测定挥发油对皮肤细胞的细胞毒性,并利用扫描电镜(SEM)观察挥发油对皮肤组织形态学的影响,初步评价挥发油的生物安全性。研究结果显示,花椒油的主要成分为4-萜品醇(18.42%)、桉叶油醇(15.49%)、柠檬烯 (7.47%) 等； 薄荷油的主要成分为薄荷醇(51.00%)2-Isopropylidenecyclohexanone(11.49%)、薄荷酮(6.11%)等。与常用化学促透剂氮酮(Azone)相比,花椒、薄荷挥发油具有更低的皮肤细胞毒性,且所选择的低中高浓度花椒、薄荷挥发油对大鼠皮肤组织形态学没有显著改变,提示其具较低皮肤刺激性。根据现代药物经皮定量构效关系研究(Quantitative structure-permeation relationships),即药物理化性质中logP值(油水分配系数)与透皮吸收关联度最强,可作为建立挥发油促进中药复杂成分促透规律的重要参数。因此,选择系列较大范围内不同logP值中药有效成分,即蛇床子素(OT, logP=3.85)、川芎嗪(TMP, logP=2.34).阿魏酸(FA, logP=1.26).葛根素(PR, logP=-0.35)、京尼平苷(GP, logP=-1.01),简化并表征中药外用制剂中复杂有效成分体系；采用体外透皮试验测定不同浓度花椒、薄荷挥发油对五个模型药物的经皮促透效果,并建立挥发油作用下药物loge值与对应药物促透倍数的关系式。研究结果显示,花椒、薄荷挥发油对五个不同油水分配系数有效成分均具有良好经皮促透作用,并随着挥发油浓度增加促透效果增强,表现出浓度依赖性关系；将系列模型药物logP值与不同浓度挥发油作用下对应药物促透倍数的对数值(logER)进行相关性分析,花椒挥发油作用下对药物促透倍数对数值与药物logP值倾向于负线性关系,即：1%花椒挥发油：logER=-0.068logP+0.0641(r=0.3620)；3%花椒挥发油：logER=-0.3488logP+2.4051 (r=0.9567)；5%花椒挥发油：logER=-0.06847logP+3.4342(r=0.9941),提示花椒油对强亲水性药物可表现出更高的促透效果；薄荷挥发油作用下药物促透倍数对数值与药物logP值逐渐呈抛物线关系,即：3%薄荷油：logER=-0.0557logP2+0.075logP+0.7292(r=0.5540)；5%薄荷油：logER=-0.0166logP2-0.4806logP+2.8279(r=0.9318),提示薄荷油对适宜亲水性药物(logP估计值约为-0.50)具有最佳促透效果。分别选择川芎嗪和葛根素作为亲脂性和亲水性模型药物,采用经皮微透析技术测定花椒、薄荷挥发油的在体经皮促透情况。首先,建立川芎嗪和葛根素的体外微透析试验系统,考察药物浓度和灌注速率对线性探针回收率的影响,采用浓差法考察探针体外回收率与传递率是否一致,在此基础上采用反向渗析法分别测定川芎嗪和葛根素的在体相对回收率。然后,根据体外透皮试验给药方案,分别测定不同浓度花椒、薄荷挥发油对川芎嗪和葛根素的在体促透效果。研究结果显示,两种药物的微透析探针回收率对药物浓度均无依赖性关系,对灌注速率呈指数性相关。浓差法测定结果显示,两种药物的探针回收率与传递率相等,表明药物在渗析膜间无相互作用,且经过探针渗析膜正向与反向的扩散相等。反向渗析法测定川芎嗪和葛根素的在体相对回收率分别为59.17±1.22%和19.85±1.60%。在体经皮微透析实验结果显示,花椒油作用下对川芎嗪和葛根素的在体促透倍数随着挥发油浓度的增加而增加,呈现出浓度依赖性关系,在体与体外相应促透倍数相关性分析显示,花椒油对川芎嗪和葛根素促透倍数的体内外相关系数分别为0.928和0.999,具良好线性相关性。而较低浓度薄荷油并未显著促进川芎嗪的透皮吸收,但当应用浓度达到5%时,表现出显著促透作用(ER=12.50),同时,薄荷油作用下对川芎嗪促透倍数的体内外相关系数为1.000。由于葛根素为偏水性药物,透皮吸收性能相对较差,且探针回收率较低等原因,采用HPLC未能有效检测到葛根素在体透皮吸收变化情况,有待进一步考察。采用体外透皮试验比较同浓度条件下花椒油、薄荷油与挥发油各主要成分的经皮促透吸收情况,其中,花椒挥发油主要成分选择为4-萜品醇(18.42%)、桉叶油醇(15.49%)和柠檬烯(7.47%)；薄荷挥发油主要成分选择为薄荷醇(51.00%)、薄荷酮(6.11%)和胡薄荷酮(1.32%)。实验结果显示,花椒挥发油及其各单体对五个模型药物的整体促透效果为：花椒油>柠檬烯>桉叶油醇≈4-萜品醇,提示花椒挥发油的促透效果优于其各单体成分。薄荷挥发油各单体成分促透效果强于薄荷油总油,所选择的各成分促透效果顺序为薄荷酮>薄荷醇>胡薄荷酮>薄荷油,加之薄荷酮和薄荷醇的促透特点类似薄荷油,提示可用这两种单体成分替代经皮促透作用相对较弱的薄荷油。测定花椒、薄荷挥发油对系列不同logP值模型药物饱和溶解度,考察不同浓度挥发油对药物热力学活性的影响；测定挥发油作用下对药物在角质层与溶剂介质的分配系数,研究挥发油对药物在皮肤中的分配变化情况。研究结果表明,花椒、薄荷挥发油可增加亲脂性药物的饱和溶解度,而对亲水性药物的饱和溶解度影响较小,提示挥发油对亲脂性药物的热力学活性具有一定影响。同时,花椒挥发油可促进亲脂性药物向皮肤角质层的转运,而薄荷挥发油更倾向于促进亲水性药物向角质层中的分配。采用傅利叶变换红外光谱(ATR-FTIR)和分子动力学模拟技术测定花椒、薄荷挥发油对皮肤角质层分子结构的影响,特别脂质非极性链和极性头区,利用透射电镜(TEM)直观观察花椒、薄荷挥发油对皮肤角质层的改变。实验结果表明,花椒挥发油可使角质层脂质C-H对称振动吸收峰(vs)与不对称振动峰(vas)向高波长方向移动,且呈浓度增加而增强,同时,可使两个C-H对称和不对称吸收峰面积减少,提示花椒挥发油可改变角质层结构及直接抽提角质层脂质作用,从而改变皮肤角质层屏障功能。而薄荷挥发油主要通过影响角质层脂质C-H不对称振动峰(vas)改变角质层结构。此外,花椒、薄荷挥发油对角质层角蛋白两个酰胺吸收峰(酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ)的峰位置和峰面积均没有显著影响,提示其对角质层内角蛋白影响较小。透射电镜结果显示,花椒、薄荷挥发油作用后,大鼠皮肤角质层层数随挥发油浓度增加而逐渐减少,且层间隙距离逐渐增大,进一步表明挥发油作用后对皮肤角质层具有显著影响,从而降低了角质层的通透屏障作用。选择HaCaT表皮角质形成细胞为皮肤活性表皮模型,测定与药物转运相关细胞功能(如细胞膜流动性、膜电位等)的改变,探讨花椒、薄荷挥发油对皮肤活性表皮的影响。实验结果显示,两种挥发油均可增加HaCaT细胞膜流动性,降低细胞膜电位,同时,花椒、薄荷挥发油可降低HaCaT细胞Ca2+-ATP酶活性、增加胞内Ca2+浓度,提示其可能通过改变细胞内外Ca2+平衡而影响相关细胞功能的改变,从而促进药物透过皮肤活性表皮层。综上所述,本课题基于中医外治处方的组方特点之一,即重用“气味俱厚”药味“率领群药,直达病所”,选择中药外用制剂中常用具该类功效药味花椒和薄荷为代表,以系列较大范围不同logP值中药有效成分的经皮渗透作用总结并推测了所选择挥发油对中药复杂成分的经皮促透特征,并基于药物经皮转运过程,从“药物热力学活性-角质层结构-皮肤活性表皮”多层次解释了其经皮促透作用机制,从而初步阐明挥发油对中药复杂有效成分的经皮促透规律及其作用机理。该课题的研究将有利于揭示中药外治机理及其配伍的科学内涵,也为指导中药外用制剂的组方配伍及开发中药经皮促透剂提供了理论指导及数据支持。