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人类耳蜗毛细胞因为感染、遗传因素、缺氧、自身免疫失调、耳毒性药物或噪声暴露而丢失后将无法再生,从而导致永久性耳聋。然而,鸟类、爬行类、两栖类、鱼类等低等动物的听觉毛细胞却具备再生能力。之前的研究主要关注毛细胞再生机制相关的信号通路,比如Wnt和Notch信号。然而,毛细胞损毁时,通常伴有大量炎症反应,这些炎症反应对毛细胞再生是否有作用仍然未知。
由于斑马鱼幼鱼侧线十分容易观察和接近,本研究使用了一种可观察到先天免疫中性粒细胞和巨噬细胞的转基因斑马鱼Tg(corola-eGFP;lyz-Dsred),用来观测毛细胞损伤后,中性粒细胞和巨噬细胞的迁移。将幼鱼先浸泡在炎症抑制剂BRS-28中,可抑制促炎因子和趋化因子如NO、IL-1β、TNF-α、Cox-2、iNOS的产生。随后将幼鱼转移到硫酸铜溶液中浸泡一小时,毁损毛细胞。再生后的毛细胞可用DASPEI标记,并在共聚焦显微镜下观测。为了评估毛细胞再生后侧线的整体功能情况,本研究通过自行设计建造的U型水槽来检测AB/WT幼鱼的趋流性,并且本实验使用行为学分析软件对趋流性进行定量评估。最后,用在位活体实时钙成像的方法观测转基因品系Huc:h2b-gcamp6f的幼鱼,评估水流刺激下单个神经丘中再生毛细胞的钙活动改变。
研究发现,斑马鱼幼鱼的侧线毛细胞被硫酸铜损毁时,损毁的毛细胞周围很快聚集了中性粒细胞,随后大量巨噬细胞也迁移过来。如果预先使用炎症抑制剂BRS-28抑制促炎因子的产生,迁移到损毁毛细胞处的中性粒细胞和巨噬细胞数量均显著减少,侧线毛细胞的再生发生延迟。对幼鱼进行趋流能力的评估发现,炎症抑制组幼鱼的趋流能力的恢复也发生延迟,直到毛细胞再生完全后,趋流能力才恢复正常。钙成像提示,正常再生组在再生的早期,毛细胞的钙活动的已经恢复到正常水平,而炎症抑制组的幼鱼,毛细胞的钙活动显著弱于正常再生组和Control组。到了再生后期,毛细胞的功能才恢复正常。研究结果表明,毛细胞损毁时,抑制炎症反应会延迟毛细胞的再生和功能的恢复。
通过以上实验结果,可认为BRS-28通过抑制促炎因子的产生,减少了迁移到损伤神经丘处的中性粒细胞和巨噬细胞数量,进而炎症解决的过程减缓。这有可能是由于巨噬细胞激活JNK的信号通路受阻,支持细胞开启补偿性增殖受影响,最终导致毛细胞再生的启动发生延迟。抑制炎症后,单个神经丘内再生的毛细胞钙活动水平较低,幼鱼整体表现出在趋流能力的降低。随着再生的完成,毛细胞钙活动水平恢复到正常水平,趋流能力也恢复至正常水平。本研究发现了炎症反应在毛细胞再生中起到的重要作用,且首次对在体的毛细胞客观评估功能提供了合适的方法,并通过钙成像的技术手段,首次探究了再生毛细胞在水流刺激下的功能情况。最终为如何使成年哺乳类动物的毛细胞再生和功能恢复提供新的思路。
由于斑马鱼幼鱼侧线十分容易观察和接近,本研究使用了一种可观察到先天免疫中性粒细胞和巨噬细胞的转基因斑马鱼Tg(corola-eGFP;lyz-Dsred),用来观测毛细胞损伤后,中性粒细胞和巨噬细胞的迁移。将幼鱼先浸泡在炎症抑制剂BRS-28中,可抑制促炎因子和趋化因子如NO、IL-1β、TNF-α、Cox-2、iNOS的产生。随后将幼鱼转移到硫酸铜溶液中浸泡一小时,毁损毛细胞。再生后的毛细胞可用DASPEI标记,并在共聚焦显微镜下观测。为了评估毛细胞再生后侧线的整体功能情况,本研究通过自行设计建造的U型水槽来检测AB/WT幼鱼的趋流性,并且本实验使用行为学分析软件对趋流性进行定量评估。最后,用在位活体实时钙成像的方法观测转基因品系Huc:h2b-gcamp6f的幼鱼,评估水流刺激下单个神经丘中再生毛细胞的钙活动改变。
研究发现,斑马鱼幼鱼的侧线毛细胞被硫酸铜损毁时,损毁的毛细胞周围很快聚集了中性粒细胞,随后大量巨噬细胞也迁移过来。如果预先使用炎症抑制剂BRS-28抑制促炎因子的产生,迁移到损毁毛细胞处的中性粒细胞和巨噬细胞数量均显著减少,侧线毛细胞的再生发生延迟。对幼鱼进行趋流能力的评估发现,炎症抑制组幼鱼的趋流能力的恢复也发生延迟,直到毛细胞再生完全后,趋流能力才恢复正常。钙成像提示,正常再生组在再生的早期,毛细胞的钙活动的已经恢复到正常水平,而炎症抑制组的幼鱼,毛细胞的钙活动显著弱于正常再生组和Control组。到了再生后期,毛细胞的功能才恢复正常。研究结果表明,毛细胞损毁时,抑制炎症反应会延迟毛细胞的再生和功能的恢复。
通过以上实验结果,可认为BRS-28通过抑制促炎因子的产生,减少了迁移到损伤神经丘处的中性粒细胞和巨噬细胞数量,进而炎症解决的过程减缓。这有可能是由于巨噬细胞激活JNK的信号通路受阻,支持细胞开启补偿性增殖受影响,最终导致毛细胞再生的启动发生延迟。抑制炎症后,单个神经丘内再生的毛细胞钙活动水平较低,幼鱼整体表现出在趋流能力的降低。随着再生的完成,毛细胞钙活动水平恢复到正常水平,趋流能力也恢复至正常水平。本研究发现了炎症反应在毛细胞再生中起到的重要作用,且首次对在体的毛细胞客观评估功能提供了合适的方法,并通过钙成像的技术手段,首次探究了再生毛细胞在水流刺激下的功能情况。最终为如何使成年哺乳类动物的毛细胞再生和功能恢复提供新的思路。