炎性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC),是一类以肠道炎症为特征的疾病。炎性肠病(IBD)的发病源于宿主因素和外界因素之间复杂的相互作用,包括多个方面,如肠道微生物系统、免疫系统、宿主的遗传组成和特定的环境因素。全球接近400万人饱受克罗恩病和溃疡性结肠炎的痛苦,其中美国大概有140万炎性肠病患者,我国炎性肠病发病率近年来明显增加。研究已经证实,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α, TNF-α)在炎性肠病发病机制中起重要作用。TNF-α可以和两种不同TNFR (tumor necrosis factor receptor)结合,TNFR1(P55)为可溶性的,TNFR2(P75)为跨膜蛋白。TNF-α通过和这两种受体结合而发挥其生物学作用,包括细胞激活和增殖、以及细胞毒性作用和诱导细胞凋亡。Tnf△ARE小鼠体内产生大量TNF-α,导致出现克恩氏病样的深层穿粘膜肠道炎症。TNF-α在其他肠道炎症模型中同样发挥重要的致炎作用,例如三硝基苯磺酸钠(TNBS)诱导的肠炎模型和白细胞介素10基因缺失(IL-10-/-)小鼠肠炎模型。在CD45RBhigh T细胞转移性肠炎模型中,持续的TNF-α抗体治疗能够减弱肠炎的严重性。使用TNF-α拮抗剂来治疗相关疾病虽已经被认可,但考虑到TNF-α拮抗剂能够增加肿瘤风险,而且只对50-70%的炎性肠病患者有效,研发新的靶标或者TNF-α拮抗剂的替代品将显得尤为重要。颗粒蛋白前体(Progranulin,PGRN)也被称为granulin epithelin precursor (GEP), PC-cell-derived growth factor (PCDGF),proepithelin和acrogranin,是一种最早从条件性组织培养物中纯化而来的分泌性生长因子。PGRN由七个半半胱氨酸基序按P-G-F-B-A-C-D-E顺序组成。PGRN可以被翻译成具有593个氨基酸片段和68.5kDa大小的蛋白。由于翻译后糖基化的修饰,PGRN在SDS-PAGE电泳上显示大小为90kDa。弹性蛋白酶和其他一些胞外基质蛋白酶都可以将PGRN降解为GRN片段,降解后的GRN片段也具有调节细胞生长的活性。PGRN在全身多种组织中均有表达,尤其在上皮细胞和造血细胞中表达量最高。PGRN在多种生理和病理过程中发挥作用,例如早期胚胎发育、伤口组织修复、炎症反应和抵抗宿主感染。PGRN还是一种重要的神经保护因子,PGRN基因突变后PGRN蛋白水平部分下降,导致神经退行性额颞叶痴呆。尽管PGRN具有多种生理和病理学功能,由于PGRN受体没有被发现,有关PGRN作用和机制的研究一直被滞后。2012年美国纽约大学刘传聚实验室首次发现TNFR为PGRN的结合受体,并通过大量实验证实PGRN通过TNFR抑制TNF-α诱导的炎症反应以及炎性关节炎的发展,为TNF-α相关疾病的治疗提供了新的希望。目前,PGRN在炎性肠病发病过程中作用还不清楚。本研究将会探讨PGRN在炎性肠病(IBD)中的作用及其机制,这不仅有助于理解PGRN在IBD致病过程中的免疫学机制,而且还有可能将PGRN用于研究和治疗其他免疫相关的疾病模型。1.生长因子PGRN在小鼠实验性肠炎中的作用为了评价野生型(WT)和PGRN基因缺失型(PGRN-/-)小鼠中PGRN对于免疫细胞发生发展的作用,我们采用流式细胞仪分析了WT和PGRN-/-小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结中MHCII+CD11c+, CD3-CD19-mPDCA-1+和CD4+Foxp3+细胞数目和比例的变化。研究结果发现PGRN基因缺失小鼠中主要免疫细胞群没有发生改变,而且没有自发性肠炎症状和免疫系统激活出现。为了检测在炎性条件下PGRN是否被诱导表达,我们采用免疫组化法检测了IBD患者结肠组织标本和小鼠3%葡聚糖硫酸钠(DSS)急性肠炎模型结肠组织中PGRN的表达情况. Real-time PCR结果发现PGRN基因在CDllb+和Ly6G+细胞中的表达高于其他免疫细胞,如T细胞和B细胞。免疫组化结果说明在IBD炎性环境中,PGRN强烈表达在结肠组织上皮细胞和炎性浸润细胞中。Western结果表明重组PGRN蛋白可以激活人小肠上皮细胞系Caco-2细胞中Erk的磷酸化。这些结果提示在炎性肠病(IBD)发生发展的炎性过程中诱导产生PGRN,而且这些PGRN在肠组织细胞中是功能性的。为了进一步检测内源性PGRN在肠炎发生发展中的作用,我们将性别和年龄匹配的野生型小鼠和PGRN基因缺失小鼠口服饮用DSS溶液建立DSS急性肠炎模型。实验结果结果发现PGRN-/-组小鼠对于DSS诱导的肠炎更加敏感,表现为明显的体重下降、腹泻和血便。PGRN-／-组小鼠DSS诱导后大肠平均长度比WT组小鼠短20%(P<0.03)。PGRN-/-组小鼠DSS诱导后结肠组织切片染色结果发现明显的组织病理学变化,发现大量炎性细胞浸润,结肠上皮出现局灶性溃疡,炎症蔓延至粘膜下层。进一步将150mg/kg三硝基苯磺酸(TNBS)溶解于乙醇中通过直肠注入小鼠诱导建立TNBS肠炎模型,我们得到了相似的结果。以上结果表明,PGRN基因缺失促进了化学试剂所致的急性肠炎的严重性,提示PGRN在实验性急性肠炎中起关键的保护作用。为了检测免疫细胞来源的PGRN是否在DSS诱导的肠炎模型中发挥保护作用,我们用WT和PGRN-/-供体小鼠的骨髓细胞重建放射处理的WT小鼠,产生了两组骨髓嵌合体模型WT/WT和KO/WT,然后诱导建立DSS肠炎模型。临床指标和组织病理学参数都表明PGRN-/-骨髓细胞移植入WT小鼠产生的PGRN-/-/WT嵌合体小鼠对于DSS的诱导更加敏感,表明免疫细胞来源的PGRN发挥了保护和抗炎作用,可以减轻DSS肠炎的损伤。我们进一步通过real-time PCR和FITC-dextran法检测了正常饮水组和DSS组WT和PGRN-/-小鼠肠道菌群组成的变化和肠通透性的改变。结果发现,PGRN基因缺失并没有导致肠道菌群的过度生长和小鼠血清中FITC-dextran水平的改变。这说明PGRN-/-小鼠DSS肠炎的严重性与肠道菌群过度生长或肠道菌群组成改变以及肠通透性改变无关。我们在肿瘤坏死因子受体(TNFR1和TNFR2)基因缺失小鼠中诱导建立实验性肠炎模型,并注射和WT肠炎小鼠相同治疗剂量的重组PGRN蛋白,结果发现,PGRN的保护效果在TNFR1-/-和TNFR2-/-TNBS肠炎小鼠中丢失。我们也发现,给予重组PGRN蛋白治疗能够减轻小鼠DSS肠炎症状,而且PBS对照组相比,PGRN治疗组DSS小鼠结肠培养物中IL-10的表达水平明显增加(P<0.01)。作为重要的抗炎因子,IL-10在炎症应答和免疫调节中发挥中心作用。进一步采用IL-10R单克隆抗体阻断法和在IL-10基因缺失小鼠中建立TNBS模型,来明确PGRN的肠炎保护作用是不是需要IL-10信号的参与。结果表明,IL-10R单克隆抗体治疗组小鼠比同型抗体组小鼠体重下降明显,结肠切片HE染色结果表现为明显的炎性细胞浸润、结肠上皮有溃疡形成和隐窝结构的改变。这说明PGRN对于DSS导致的小鼠体重下降的保护作用可被anti-IL-10R抵消。同时我们也观察到PGRN的治疗保护作用在IL-10-/-TNBS小鼠中消失。以上结果证实PGRN上调IL-10的表达,PGRN介导的肠道炎症保护作用需要IL-10信号分子的参与,这是PGRN发挥保护作用的重要机制之一。综上所述,本研究发现在急性小鼠实验性肠炎模型中,PGRN在多种细胞中诱导表达产生并参与调节肠道自稳。PGRN基因缺失促使了小鼠实验性肠炎的发生发展,重组PGRN蛋白能减轻小鼠实验性肠炎的症状,说明PGRN在急性小鼠肠炎中起保护作用。嵌合小鼠模型提示,造血细胞来源的PGRN在急性小鼠肠炎中起主要保护作用。研究进一步证实PGRN介导的肠道炎症保护作用机制与上调IL-10的表达有关。IL-10作为一种重要的组织微环境调节因子参与修复肠道炎症。总之,本研究明确了PGRN在调节肠道炎症方面的重要作用,将有助于设计新的策略用于肠道炎症的治疗。2.生长因子PGRN在T细胞中功能的初步研究为了明确PGRN在CD4+Foxp3+调节性T细胞发生发展中的作用,我们采用流式细胞仪分析了1周龄、3周龄和6周龄WT和PGRN-/-小鼠中CD4+Foxp3+细胞的数目变化,结果发现WT和PGRN-/-小鼠胸腺、脾脏和淋巴结中CD4+Foxp3+调节性T细胞的比例没有明显差异,这说明PGRN不是体内天然产生的调节性T细胞(naturally regulatory T cells, nTreg)发生发展所必需的。为了进一步探讨PGRN是否调节诱导产生的调节性T细胞(inducible regulatory T cells, iTreg)的发生发展,我们用固相CD3抗体和可溶性CD28抗体刺激CD4+CD25-T细胞,在存在或不存在TGF-β和PGRN的条件下诱导培养3天。实验结果发现,PGRN能够增加,而且是剂量依赖性的增加0.1ng/mlTGF-β诱导CD4+CD25-T细胞转分化为iTreg的数目。即使在不存在TGF-β的条件下,PGRN也能够增加CD4+CD25-T细胞转分化为iTreg的数目(从0.19%到7.51%)。说明PGRN能够诱导iTreg的发生发展。为了研究PGRN基因缺失是否影响了Treg的功能,我们进行了Treg体外抑制增殖实验。每个96孔板中加入5×105个CFSE标记的Teff细胞,1×105个APC细胞和按照各种比例加入流式纯化的WT或PGRN-/-Treg细胞,在含有5ug/mlCD3抗体的RPMI1640培养基中培养72小时。结果表明,当Teff和Treg细胞按照1：2和1：1混合时,PGRN-/-Treg细胞体外抑制Teff增殖的能力明显低于WTTreg细胞(P<0.05)。为了进一步分析WT和PGRN-/-Treg功能差异的分子机制,采用流式细胞仪和Real-time PCR分别检测了WT和PGRN-/-Treg细胞中BrdU和Wnt家族基因的表达水平。结果发现PGRN基因缺失并没有影响Treg的细胞增殖能力,而PGRN-/-Treg细胞中wnt受体基因Fzd2mRNA水平明显升高(P<0.01)。为了明确PGRN信号在小鼠体内CD4+T细胞中的作用,我们将来自WT和PGRN-/-小鼠的CD4+CD25-CD45Rbhi T移植到Rag1-/-小鼠中。实验结果表明,Ragl-/-小鼠被PGRN-/-供体的CD4+CD25-CD45Rbhi T细胞重建后加速了体重的下降过程,组织病理学发现严重的结肠组织病理学改变,包括大量的炎性细胞浸润、杯状细胞丢失、结肠上皮破损和隐窝结构的改变。PGRN-/-CD4+CD25-CD45Rbhi T细胞重构后Ragl-/-小鼠肠炎的严重性可能与减少激活引起的细胞死亡有关,导致CD4+T细胞的大量积累。综上所述,本研究发现了PGRN在nTreg和iTreg发生发展中的作用,PGRN单独和协同TGF-p都可以CD4+CD25-T细胞转分化为iTreg。PGRN基因缺失减低了Treg细胞体外抑制Teff增殖的能力。研究进一步证实PGRN调节Treg功能的作用机制与wnt信号分子Fzd2的表达有关。体内试验提示PGRN基因缺失促进了小鼠T细胞过继性肠炎的严重性和进程。总之,本研究明确了PGRN在T细胞尤其是Treg细胞中的重要作用,将有助于研究IBD的免疫学机制和治疗。总而言之,我们的研究结果发现在多种小鼠实验性肠炎模型中,PGRN在多种细胞中被诱导表达并参与肠道炎症的调节。PGRN基因缺失促进了化学试剂诱导的急性肠炎和T细胞过继性慢性肠炎的严重性和疾病进程。免疫细胞来源的PGRN在DSS急性肠炎中具有保护作用。重组PGRN蛋白可以减轻DSS急性肠炎的严重性。IL-10作为一种重要的肠道炎症调节因子参与PGRN介导的肠炎保护作用。进一步研究发现PGRN可以调节iTreg细胞的产生和Treg细胞的功能,PGRN对Treg细胞功能的调节与wnt信号分子Fzd2上调有关。综上所述,本研究明确了PGRN在调节肠道炎症中的重要性,将为研究肠道炎症的免疫学机制和治疗提供新思路。