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MUC1蛋白是一种高分子量糖蛋白,在人膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等腺上皮细胞均有表达。MUC1可作为免疫治疗的靶点是基于以下特点:(1)肿瘤细胞表达量增高,为正常的100倍以上;(2)肿瘤细胞MUC1广泛分布,而正常细胞MUC1呈极性分布;(3)糖链的糖基化不全,导致正常情况下隐蔽的肽链表位暴露。MUC1的免疫原性区域主要位于该蛋白分子胞外段的20个氨基酸重复序列区域(VNTR)。MUC1能引起T细胞免疫应答 ,通过T细胞受体直接识别,不受主要组织相容性复合体限制。MUC1还能引起B细胞免疫应答产生抗体。目前已有多种基于MUC1的免疫原作为疫苗用于肿瘤治疗的研究 ,有些已经进入临床试验阶段。为分析研究MUC1蛋白的结构和功能关系,了解其表面特性,本课题首先在方法学比较的基础上,联合运用多种方法对MUC1蛋白的二级结构和表面特性,如理化性质、亲水性、免疫原性等方面进行分析和预测。结果发现: MUC1存在有多个潜在的抗原表位位点; 位于胞外段的抗原表位位点见于VNTRs(含PDTR) 140aa-156aa, 159aa-174aa,179aa-196aa。选择针对该核心抗原表位的单抗,用于筛选随机肽库,有可能获得其抗体识别的模拟表位。采用离子交换柱层析从腹水中纯化了针对MUC1蛋白的鼠源性BC2抗体,洗脱液第3峰(命名为BC2 D3)含有纯度较高的BC2抗体(22KD、52KD),经Kodak成像系统进行扫描,所得BC2蛋白纯度约为90%,可用于MUC1抗原模拟表位的筛选。运用噬菌体随机7肽库技术,以纯化的BC2抗体为靶蛋白,进行噬菌体随机肽库 3 轮筛选,根据插入区的核酸序列推导出外源多肽的氨基酸序列,获得了MUC1抗原模拟表位TAPDLRP(x19),SAPDLRP(x9),AAPDSRP(x1)及 LAPDFRP (x1)。比较所获得的多肽氨基酸序列,依据其氨基酸序列同源程度,获得其同源性基序:XAPDXRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上,能较大程度地特异性抑制抗原抗体结合,提示这些阳性克隆的外源肽具有一定的MUC1抗原模拟功能。为证实模拟抗原的免疫原性,进一步用展示MUC1抗原模拟表位的噬菌体阳性克隆免疫小鼠,3次免疫小鼠后,血清(1:1000)中能检测到较强的MUC1抗体阳性;以最大OD450值之纯化血清做为一抗行蛋白印迹分析,结果显示:纯化血清可识别<WP=10>MUC1蛋白;小鼠脾脏淋巴细胞增殖率检测结果表明:噬菌体展示肽表位可在无佐剂存在情况下,大大促进小鼠的脾淋巴细胞的增殖,证明噬菌体是一较好的生物载体。结果表明该模拟抗原免疫小鼠后能激发体液及细胞免疫应答,具有良好的免疫原性。 本研究对MUC1二级结构和表面特性的分析结果,为进一步研究MUC1结构和功能、构建MUC1突变体和选择表达新型MUC1分子奠定了基础。通过噬菌体随机肽库的筛选,获得了MUC1抗原模拟表位,为将来研制人上皮来源性肿瘤疫苗奠定了实验基础。