转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2)是一种重要的转录因子,能够在肝脏中调控一系列解毒及抗氧化防御基因的表达。它的激活能够对亲电体做出应答,并通过与抗氧化反应元件(ARE)相结合,介导目的基因的表达。Nrf2-ARE信号通路在肝脏疾病中的作用越来越受到关注。因此,本课题就Nrf2在高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型以及胆管结扎(BDL)诱导的小鼠胆汁淤积性肝损伤模型中发挥的作用进行研究探讨。第一部分Nrf2缺失使雌激素降低肝脏脂肪的作用增强目的Nrf2能够调控包括肝脏脂类代谢在内的多种生物进程。雌激素能够发挥能量调节的作用如肝脏的降脂作用。越来越多的证据显示这两种因子之间有相互交联的关系。然而Nrf2和雌激素能否通过相互作用来调节肝脏的脂肪代谢,目前尚未见报道。因此本研究采用高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝模型,来观察Nrf2信号通路是否能够调节雌激素在肝脏脂肪代谢中发挥的作用。方法1.高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立和分组处理雄性Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠各25只,分别将其随机分成普通饮食饲养组,高脂饮食饲养组。高脂饮食饲养组再分为溶剂对照组,雌二醇(estradiol, E2)组,黄体酮(progesterone, P)组,以及雌二醇和黄体酮混合组。高脂饮食组给予高脂饮食(HFD)饲养,16周后,分别腹腔注射溶媒,E2,P以及E2+P,每天一次,连续三周,同时继续给予高脂饮食饲养。三周后处死动物,解剖获取动物的肝组织,称重,计算肝重比。随后进行肝组织苏木精-伊红(HE)染色和油红脂滴染色。2.免疫组化SP法检测FABP5和TFF3蛋白的表达采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复,S-P法免疫组织化学染色,用DAB/H2O2显色,苏木精复染检测脂肪酸结合蛋白-5(Fatty acid binding protein 5, FABP5)、三叶肽因子-3(Trefoil factor family 3, TFF3)蛋白的表达。用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。3.肝组织中脂质含量的检测采用试剂盒检测肝脏中的甘油三酯,总胆固醇以及游离脂肪酸的含量,具体操作遵循试剂盒说明书。4.实时荧光定量RT-PCR法对mRNA的水平进行检测TaqMan通用的PCR混合液和探针,以及小鼠Nrf2 (Mm00477786_ml), NQO1 (MmO1253561_ml), ERa(Mm00433149_ml), ERβ(Mm00599821_ml), TFF3 (Mm00495590_ml), FABP5 (Mm00783731_s1),以及albumin (Mm00802090_m1)探针均购于Applied Biosystems (Foster City, CA)。扩增反应在ABI Prism 7900序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)中进行。5. Western blot法检测肝组织中NQO1,ERa,FABP5蛋白的表达提取肝组织中的总蛋白,Western blot法进行组织化学染色,用ECL进行显色,检测肝组织中NQO1,ERa,FABP5蛋白的表达。结果1.Nrf2的缺失使雌激素在非酒精性脂肪肝中降低肝脏脂肪的作用得到增强19周后处死动物,获取肝组织,我们发现与普通饮食饲养的小鼠比较,高脂饮食诱导的两种基因型小鼠在溶剂对照组中,肝脏增大,有大量的脂肪堆积。与溶剂对照组相比,给予外源的雌激素会导致两种基因型的小鼠肝脏体积缩小,脂肪堆积减少,发挥降低脂肪肝的作用。组织学的评估显示当Nrf2缺失时,雌激素的降脂效果显著增强。为了更进一步证明以上发现,我们对肝组织进行油红染色观察肝组织中脂肪堆积情况。结果显示,与溶剂对照组比较,雌激素治疗降低了野生型小鼠肝脏中脂肪的含量,值得注意的是,雌激素的治疗几乎使Nrf2缺失小鼠肝脏中的脂肪完全消失。2.Nrf2缺失同时给予雌激素治疗使非酒精性脂肪肝组织中TFF3和FABP5蛋白的表达增强在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝中,给予外源的雌激素可以增加两种基因型小鼠肝脏中TFF3和FABP5蛋白的表达。当Nrf2缺失同时给予雌激素治疗时,TFF3和FABP5蛋白的表达相较于野生型小鼠显著增强。3.Nrf2缺失同时给予雌激素治疗使非酒精性脂肪肝组织中甘油三脂,胆固醇,游离脂肪酸含量降低相较于普通饮食组小鼠,高脂饮食诱导的小鼠,肝组织中的甘油三酯,总胆固醇和游离脂肪酸过度堆积。在野生型小鼠中,相对与溶剂对照组,给予外源的雌激素降低了肝脏中的甘油三酯,游离脂肪酸的含量,而对总胆固醇没有显著的影响。当Nrf2缺失时,相对于溶剂对照组,外源的的雌激素显著的降低了肝脏中甘油三酯,游离脂肪酸和总胆固醇的含量。4.Nrf2缺失同时给予雌激素治疗能够提高非酒精性脂肪肝组织中的TFF3mRNA水平实时定量RT-PCR结果显示,在野生型小鼠中,相比较于普通喂养的小鼠,高脂饮食喂养使Nrf2激活,并上调了Nrf2和NQO1基因的表达。雌激素治疗组对Nrf2没有显著的影响,对NQO1的转录水平有略微的提高。普通喂养的小鼠中,Nrf2的缺失导致ERα mRNA, TFF3 mRNA的表达增强。与普通喂养的小鼠比较,高脂饮食喂养的野生型小鼠肝脏ERα mRNA的表达水平提高,而Nrf2缺失的小鼠ERα mRNA的表达水平降低。值得注意的是,雌激素治疗的野生型小鼠肝组织中TFF3 mRNA的表达有所提高,而Nrf2缺失同时给予雌激素治疗的小鼠肝组织中TFF3 mRNA的表达有着更为显著的提高。结论1.Nrf2在肝脏脂肪代谢过程中与雌激素信号通路起到对抗的作用。2.肝脏中FABP5的表达水平与雌激素降低脂肪肝的作用呈正相关,Nrf2能够抑制外源雌激素治疗的肝脏中FABP5的表达。第二部分 Nrf2缺失在胆汁淤积症中使肝实质细胞的类肝样细胞CD133+表达增强目的核转录因子Nrf2是细胞防御系统对抗氧化应激和炎症发生的中心调控因子,它同时也涉及疾病诱导的肝损伤引起的肝脏再生。CD133被广泛的作为肝脏前体细胞标记物,然而Nrf2信号通路是否参与修复胆汁淤积性的肝脏损伤并调节CD133的表达目前尚不清楚。因此本研究采用BDL诱导的胆汁淤积性肝损伤模型对Nrf2信号通路能否调控肝脏的修复功能,是否与肝脏前体细胞相关进行探讨。方法1. 胆汁淤积性肝损伤模型的建立和分组处理雄性Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠各50只,分别将其随机分成对照组,BDL组。整个饲养周期采用标准饮食饮水。在无菌环境中对小鼠进行胆总管结扎手术和假手术。采用吸入性麻醉剂对小鼠进行麻醉,将胆总管暴露,间隔2毫米,用两根线,对胆总管进行结扎,将两根线之间的胆总管切开。对照组的小鼠进行假手术,将胆总管暴露,但不进行结扎。分别在手术后的不同时间点处死小鼠,获取肝脏,称重,计算肝重比。2. 免疫组化SP法检测Ki67,Laminin,CK19,CD133蛋白的表达采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复,S-P法免疫组织化学染色,用DAB/H2O2显色,苏木精复染检测Ki67,Laminin,CK19,CD 133蛋白的表达。用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。3. Western blot法检测肝组织中NQO1,CD133,CK19蛋白的表达提取肝组织中的总蛋白,Western blot法进行组织化学染色,用ECL进行显色,检测肝组织中NQO1,CD133,CK19蛋白的表达。结果1.Nrf2的缺失不会导致胆总管结扎后肝脏损伤加强Nrf2的缺失不能够影响胆总管结扎所诱导的肝脏体积的变化,肝细胞的增殖,以及肝脏纤维化的水平。2.Nrf2在胆汁淤积症的发展过程中被持续激活NQO1是一个典型的Nrf2靶基因,有研究显示在胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝损伤中,NQO1仅仅受到Nrf2的调控。我们的研究发现野生型小鼠肝脏中NQO1蛋白的表达随着胆汁淤积症的发展逐渐增强,当Nrf2缺失时,NQO1蛋白的表达完全被阻止。这个发现显示在胆汁淤积症中,肝脏Nrf2具有持久和强大的活化作用。3.Nrf2的缺失导致类肝样细胞内CD 1 33+表达增强免疫组化以及Western blot结果均显示,Nrf2基因的缺失会导致类肝样细胞CD133的阳性表达显著增强,揭示了Nrf2是肝脏前体细胞一个至关重要的调控因子。结论1.Nrf2的缺失不会导致胆总管结扎后肝脏损伤加强。2.在胆汁淤积症的发生发展过程中,Nrf2具有持续活化的作用。3.Nrf2的缺失导致类肝样细胞内CD133+表达增强,表明Nrf2是肝脏前体细胞一个至关重要的调控因子。