背景与目的:放疗是指利用放射线电离辐射(Ionizing Radiation,IR)效应杀伤肿瘤细胞的治疗方法,在头颈部恶性肿瘤治疗中占有重要地位。据文献统计,全球每年新增头颈癌病例约5492200人,超过50%的患者在治疗过程中需要接受放疗。临床上,放疗除治疗作用外,常引发的并发症是皮肤的急性损害(主要表现为皮肤红斑、干燥脱屑、毛发脱落、溃疡等)及外科手术后皮肤伤口愈合障碍。后者主要表现为局部手术伤口延迟愈合、不愈或反复破溃,增加了创伤部位感染及组织坏死的几率,最终转变为辐射性皮肤溃疡。这不仅严重影响患者生活质量,也是口腔颌面外科医生深感棘手的临床难题之一。皮肤伤口愈合是一个复杂、协调有序的组织修复再生过程,涉及多种细胞及细胞因子共同参与。皮肤损伤后通过凝血、肉芽组织再生、组织重建等一系列反应实现自愈。皮肤成纤维细胞(fibroblasts,FBs)的激活和增殖是组织修复的中心环节,在伤口愈合过程中发挥重要作用。P53蛋白作为较早发现的抑癌基因,在维持细胞基因组稳定方面有至关重要的作用。我们前期实验结果证实,辐照后小鼠与人成纤维细胞中P53凋亡通路处于激活状态,P53及其下游蛋白P21转录与蛋白水平均持续增高。因此,我们推测p53相关凋亡可能在辐照后伤口创面愈合中发挥重要作用,通过其自身表达量的高低来调节皮肤成纤维细胞有关的皮肤愈合和瘢痕的形成与重构。本研究希望通过对小鼠与人皮肤成纤维细胞辐射条件的摸索,建立了更加符合临床实际的细胞辐照模型,在此基础上,明确该通路与辐照后皮肤成纤维细胞的增殖减慢的关系,为今后促进辐照后伤口的愈合提供新方法、新思路。方法:1、建立可传代的小鼠与人类辐照损伤皮肤成纤维细胞模型。将体外培养的皮肤成纤维细胞经胰酶消化后悬浮于15ml林信管中,在辐照源处给与10Gy的g射线辐照,辐照后传代培养。2、检测小鼠与人类辐照后传代成纤维细胞系的增殖、凋亡、迁移能力,比较辐照后长期传代细胞与正常非照射细胞之间的差异。3、对长期传代的成纤维细胞系进行全转录组测序,观察P53通路变化情况,验证最初的实验推论是否正确。4、观察P53通路在蛋白水平的变化及其与转录水平有何异同。5、用P53抑制剂对P53通路进行阻断,观察阻断P53相关凋亡通路后,相关辐照细胞的增殖变化情况。实验结果:1、CCK-8细胞增殖实验结果显示,小鼠成纤维细胞辐照后第1代细胞的增殖与未辐照组相比明显减慢,在传代过程中,这种差异基本保持不变。镜下拍照结果显示,第1代细胞在g射线辐照后细胞形态未见明显变化,在此后的传代过程中,细胞形态发生不规则改变,呈现凋亡前形态。免疫荧光染色结果也同样发现辐照后细胞增殖减弱,增殖相关标志物Ki67蛋白在辐照组明显减少。与小鼠成纤维细胞辐照后结果类似,人类皮肤成纤维细胞传代后增殖能力未能恢复。镜下结果也与小鼠皮肤成纤维细胞类似,辐照后第1代细胞未出现明显的形态改变,传代后第3代可见细胞形态结构松散。2、用FITC与PI双重标记辐照前与辐照后小鼠成纤维细胞后发现,细胞传代后,辐照组细胞持续存在凋亡现象,细胞传代至第3代总凋亡数目与第3代对照组比较依然有明显统计学差异(P<0.05)。辐照后第3代细胞凋亡数量较第1代有所增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。人类皮肤成纤维细胞结果与小鼠皮肤成纤维细胞结果类似,辐照组早期凋亡与晚期凋亡细胞数目均有所增加,总凋亡数与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3、小鼠皮肤成纤维细胞辐照后第1代细胞与对照组相比较迁移率未见有明显减低(P>0.05),传代后第3代细胞迁移率较对照组减慢且差异有统计学意义(P<0.05=,辐照后小鼠皮肤成纤维细胞的迁移能力随细胞代数增加而减弱。在人类皮肤成纤维细胞中重复上述实验后,得到的结果与小鼠皮肤成纤细胞结果相一致,即细胞迁移随代数的增加而减慢,辐照传代后第3代细胞与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。4、小鼠皮肤成纤维细胞辐照后第3代细胞行H2Ag标记受损细胞核后发现,辐照组细胞H2Ag染色阳性细胞较对照组明显增多,差异有无统计学意义。5、小鼠皮肤成纤维细胞辐照后细胞周期明显改变,DNA合成前期G1期变短,而DNA合成后期G2期相应延长,S期、M期未见明显变化。6、对辐照后的长期传代的小鼠皮肤成纤维细胞进行全转录组测序后发现,P53通路上调明显,对其下游靶基因P21蛋白检测后发现,在第1代与第3代样本中P21蛋白含量有升高,提示辐照后P53通路的确存在异常激活。在人皮肤成纤维细胞中重复上述实验,发现与小鼠皮肤成纤维细胞相类似,P53通路在全转录组测序后显示,处于明显激活状态,但P53通路相关基因表达量与小鼠细胞相比有所下降,经蛋白检测后发现,第1代与第3代辐照细胞中P21蛋白含量均有升高,提示P53处于持续激活状态。7、应用P53抑制剂Pifithrin-a处理细胞后,P53下游基因P21的表达量明显下降,提示抑制剂作用效果良好。在抑制剂作用于辐照后小鼠第3代皮肤成纤维细胞3天(72h)后发现,抑制剂作用组细胞数量增加,与DMSO作用组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究建立了更接近临床实际的可传代的小鼠与人类辐照损伤成纤维细胞模型,在该模型的基础上进一步研究可能引起伤口愈合减慢的原因,发现辐照后长期传代细胞存在增殖持续减慢、凋亡持续增加的现象,迁移能力随代数的增加而减弱。在对辐照后可传代的细胞进行全转录组测序后发现,P53凋亡通路异常激活,在阻断该通路后,能够部分恢复辐照后细胞的增殖能力,为今后促进辐照后伤口的愈合治疗提供了新思路。