目的:前列腺癌(Prostate cancer,PCa)在全球男性新发恶性肿瘤中排名第二,而其死亡率排在第五位。虽然我国前列腺癌患病率在男性中排第六位,但却是少有的发病率持续上升的肿瘤。造成这种现象主要的原因是随着我国经济的发展,居民饮食结构发生了变化,平均寿命延长,体检越来越普及,这种传统观念上的“富贵病”发病率自然升高了。前列腺癌已逐渐成为泌尿外科的主要疾病。传统前列腺癌依据前列腺特异抗原(Prostate specific antigen,PSA)表达高低进行筛查,利用前列腺穿刺活检取组织,病理确诊并对前列腺癌进行分级。PSA的高低及病理评分与肿瘤的预后相关,但随着病人的异质性及药物的发展,这种预后指示效果已不如从前。PCa是一种激素依赖性肿瘤,大部分的肿瘤细胞依赖雄激素受体通路生存、增殖。因此目前针对PCa的治疗主要是阻断雄激素的合成,进而抑制雄激素受体的功能。虽然雄激素阻断治疗效果显著,但随着肿瘤的进展,许多患者的PSA会再次升高,进入致死性的去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)阶段。活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)在体内分布广泛。它既可以作为胞内信号分子,参与多种信号通路的转导,又可以随着自身的积累对蛋白质、脂质、DNA等生物大分子进行损伤。ROS引起的DNA损伤超过了细胞自身的修复能力则可能引起细胞的恶性突变,并促进细胞向恶性转化。细胞内产生ROS与清除ROS的机制存在动态平衡,平衡一旦被打破,则细胞会走向死亡。多数情况下,ROS通过攻击线粒体来启动凋亡程序。在PCa中,由于患者年龄大,并伴随着高脂饮食等不良习惯,肿瘤微环境中的ROS水平较正常前列腺高。在雄激素阻断治疗、化疗及放疗过程中,细胞的凋亡也会产生更多的ROS,而这些ROS可以通过肿瘤微环境传递给尚未受损的细胞,引起连锁反应。环境中的ROS如何影响肿瘤的进展仍需进一步研究。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在真核细胞中广泛存在,并可以被各种因素激活。它是一种保守的三级激酶信号通路,三级激酶受到复杂的调控,当其完全激活后可以引起二级激酶的磷酸化,被激活的二级激酶进一步磷酸化一级激酶,激活的一级激酶调节转录因子的功能,从而影响细胞功能。其中一级激酶JNK可以引起细胞凋亡,而一级激酶ERK1/2可以促进细胞生存。前列腺相关蛋白4(Prostate associated gene 4,PAGE4)是一个应激反应蛋白,它在胚胎发育过程中活跃,在成熟睾丸中天然存在,而在正常前列腺中不表达。在前列腺增生、癌前病变及早期前列腺癌中PAGE4呈高表达,而在CRPC及转移性前列腺癌中表达水平较低。提示PAGE4的分布与PCa的恶性程度密切相关。PAGE4是一种内在无序蛋白,没有固定的三维空间形态,磷酸化激酶通过对其不同的氨基酸位点磷酸化来改变内在无序蛋白的形态,从而影响蛋白的功能。而一些研究表明PAGE4可以在PCa中减少ROS的产生,因此深入地研究PAGE4在PCa中的作用并分析其分布情况可以为判断前列腺癌预后提供参考,并可能为PCa的治疗开启新的思路。研究方法:本研究利用过氧化氢模拟ROS刺激,在前列腺癌细胞中观察PAGE4的表达情况,并建立条件过表达PAGE4的前列腺癌细胞系模型,初步探讨PAGE4在前列腺癌细胞受到ROS刺激后的反应及功能。利用单细胞电泳观察PAGE4对ROS引起的DNA损伤的影响;利用流式细胞技术检测PAGE4对ROS引起的凋亡的影响。利用RNA测序技术观察前列腺癌细胞受到ROS刺激后的基因转录水平的变化,并通过生物信息技术分析受到PAGE4调控的信号通路。利用蛋白免疫印迹法在蛋白水平检测受到PAGE4调控的信号通路,在病人组织中利用免疫组化方法进一步验证。在动物模型中观察小鼠前列腺癌细胞系移植瘤的大小判断PAGE4对其影响,并对移植瘤中的肿瘤恶性相关基因加以分析。在肿瘤基因组图谱数据库中对PAGE4与前列腺癌的预后进行联合分析。结果:1、ROS刺激可以引起前列腺癌细胞中的PAGE4水平升高,且PAGE4的表达量与过氧化氢的剂量、处理时间呈正相关。这种PAGE4表达量的升高可以被还原剂抑制。2、在条件过表达PAGE4的前列腺癌细胞模型中,PAGE4可以抑制细胞内源性ROS的产生。外源性ROS仍可以引起PAGE4的升高,提示细胞中PAGE4受ROS刺激升高的表达量可能由转录后因素调控。而不同磷酸化水平的PAGE4对细胞内源性产生的ROS抑制作用不同。3、过表达的PAGE4可以显著地减少ROS引起的前列腺癌细胞DNA损伤,其单细胞电泳中彗星尾的长度及DNA含量都比对照组少;过表达的PAGE4也可以显著的减少ROS引起的前列腺癌细胞的凋亡。4、RNA测序提示在ROS刺激下,PAGE4高表达的前列腺癌细胞中,DNA损伤修复通路更加活跃,MAPK通路被激活。5、在细胞水平中检测MAPK通路关键分子,JNK及其上下游分子因PAGE4过表达而被抑制,而ERK1/2则被PAGE4高表达激活。病人组织中也可以观察到PAGE4对ERK1/2的激活。6、PAGE4抑制了前列腺癌移植瘤在小鼠体内的凋亡,表现为生长优势,而PAGE4过表达的移植瘤中,前列腺癌恶性相关基因表达量较对照组低,提示PAGE4促癌症生长但抑制癌症进化的效果。7、PAGE4高表达的前列腺癌患者有较长的无病生存期。结论:1、在前列腺癌细胞中,ROS可以引起PAGE4表达量的升高,这种升高可以减少细胞内源性ROS的产生,促进细胞中ROS的平衡。2、PAGE4减少内源性ROS的产生主要通过转录后水平调控,PAGE4的特异性激酶CLK2和HIPK1通过改变PAGE4磷酸化的水平从而改变其空间结构来发挥功能。3、过表达PAGE4可以显著减少ROS引起的前列腺癌细胞DNA损伤及细胞凋亡,说明当细胞受到ROS刺激时,引起PAGE4升高是细胞的一种自我保护机制。4、PAGE4过表达可以促进前列腺癌细胞系DNA损伤修复相关基因地表达,主要激活MAPK通路。5、细胞及组织水平均可以观察到PAGE4对前列腺癌细胞中MAPK通路的激活。6、PAGE4可以促进前列腺癌细胞的致瘤能力,但抑制了前列腺癌细胞向恶性肿瘤地进化。7、在病人中,高表达PAGE4的患者往往有着更好的预后。可能由于PAGE4减少因ROS刺激引起肿瘤细胞的DNA损伤,进而减少癌细胞的突变,最终降低其恶性进化,使患者无病生存期更长。