【背景】　　1.关于多溴联苯醚（Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs）　　多溴联苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs)是目前生产量和使用量最大的溴化阻燃剂，根据苯环上溴原子的个数和位置的不同，多溴联苯醚总共有209种同分异构体，被广泛地应用在塑料制品、电路板和建筑材料等领域，而且PBDEs在这些产品中的比重占到5％~30%。近年来，PBDEs在环境中的浓度增长相当快，大约每隔2-5年增加一倍，人体内PBDEs的含量呈持续上升趋势，据报导在PBDEs应用于人类约25年的时间内，PBDEs在血液中的水平已经增长了100多倍。目前研究认为，PBDEs主要通过食物链、呼吸及皮肤进入机体后多数积累在脂肪组织，对机体健康产生不良影响，如：破坏甲状腺激素，削弱学习和记忆能力，改变行为举止，使听觉神经受损，积聚于靶器官如睾丸、卵巢等，减低精子数，导致胎儿畸形，甚至引发癌症等。孕期的动物接触了 PBDEs，子代会出现体重减低、肝脏肿大、高胆固醇血症，并严重损害胎儿健康，造成子代畸形、心脏肿大、肋骨弯曲、体重增加小等异常。有报道称，PBDEs对母体里的胎儿或初生幼儿的伤害，比对成年者严重，而且所需剂量较小。因此,自2007年始，美国以及欧洲等地相继限制低溴化合物如 BDE-47,99,153等的生产及使用。　　2．关于BDE-209（Brominated Diphenyl Ethers-209,BDE-209）　　BDE-209(Decabrominated diphenyl ether，BDE-209)是多溴联苯（PBDEs）家族中使用最广泛的一种同源物。研究发现低溴类具有与多氯联苯( Polychlorinated biphenyl，PCBs)类似的生物毒性，故被禁用。而高溴类BDE-209的生态健康毒性目前仍不确定，由于热稳定性好，添加量少，价格便宜等优势，目前应用最广泛，占阻燃剂总量的75％。我国更是生产、使用 BDE-209最多的国家。虽然有文献报导 BDE-209在人体的蓄积率较低溴联苯醚弱，同时 BDE-209存在光降解效应，但因为目前环境中的 BDE-209浓度远大于其它形式的含溴阻燃剂，长期大量的暴露在体内蓄积一样可能引发严重的毒性作用。越来越多的研究发现BDE-209与其他低溴类一样具有生物毒性，包括神经发育毒性、免疫毒性、内分泌毒性以及致癌性等，母体内 BDE-209也可通过胎盘屏障及乳汁传递至胎儿。我们前期的研究发现大鼠妊娠期及哺乳期经口暴露 BDE-209后，仔鼠不仅学习记忆能力显著下降，而且数目和体重也有明显下降。在机制研究方面，BDE-209可影响甲状腺激素的动态平衡以及神经递质分泌，可造成仔鼠神经突触数目的减少及超微结构的改变，引起神经元细胞凋亡、增加氧化应激损伤、整体 DNA甲基化水平的升高，并可影响神经干细胞的增殖与分化。一般认为目前地球生物暴露的浓度尚不足以导致明显的生物毒性，但是随着时间的推移，BDE-209的长期环境蓄积及生物放大作用必将会达到影响生物机能的临界水平，所以应该尽量避免人类长期暴露于BDE-209。　　3．关于孕期窒息( perinatal asphyxia）　　神经系统发育异常和功能缺陷是威胁儿童健康的重要因素之一，其在先天性发育异常中占有重要比例，约28.11%，每年因神经系统发育异常造成的直接经济损失超过2亿元。孕期窒息容易导致新生儿缺氧缺血性脑损伤的发生，而新生儿窒息后缺氧缺血性脑损伤(hypoxia isehemia brain damage，缩写HIBD)是造成儿童神经系统伤残的首要原因，常导致新生儿遗留脑性瘫痪、癫痫、智力低下等严重的神经系统后遗症。孕期窒息是导致神经发育异常的主要原因之一。Tan等发现胎羊宫内窒息后，胎羊脑组织出现充血、水肿及梗塞，并指出这种变化与在新生儿中观察到的一致。Mallard等认为窒息对神经系统异常的模式与程度有很大的影响,且随着胎龄的增加,神经元对损伤的易感性增强。Ikeda发现大鼠单侧窒息可导致选择性和长期持续的学习记忆受损。常燕群等研究揭示窒息可损害大鼠突触传递效能的长时程增强(1ong-term potentiation，LTP)的诱导，这可能是脑缺氧缺血在突触水平上影响学习记忆的重要神经机制。Aydemir等发现，氧化应激平衡失调更容易发生在孕期窒息新生儿身上，并和神经系统损伤严重程度具有相关性。目前通过研究宫内窒息的动物模型，已经证实实验动物大脑有典型凋亡现象提示宫内窒息过程中有分子机制的存在，同时观察到大脑的不同区域对于窒息损伤的易感性不同。环境化学因素是近年导致神经发育异常的众多因素中备受关注的另一重要因素。因为，在神经发育的过程中，对环境化学因素的毒性作用特别敏感，可导致严重的神经发育异常，而且日益增多的证据表明已受环境因素影响的胎儿更易受孕期窒息影响而产生神经发育异常。　　本课题主要从动物模型及体外试验两方面进行研究，在前期实验基础上，建立母源性BDE-209暴露后发生孕期窒息的动物模型，进一步了解孕期低剂量BDE-209暴露对窒息新生鼠神经发育异常的影响。通过光镜观察海马神经元细胞的形态与突触发育情况，检测海马神经元的细胞存活率，测定窒息新生鼠海马组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶活力及海马神经元细胞的凋亡率，初步探讨孕期低剂量BDE-209暴露对窒息新生鼠海马组织的毒性影响及相关作用机制。本课题分为以下三个部分进行各项具体实验。　　第一部分、孕期低剂量BDE-209暴露对窒息新生鼠海马神经元细胞形态学的影响　　【目的】　　12周龄SD雌性大鼠建立孕期低剂量BDE-209暴露后发生窒息的动物模型，取新生SD大鼠（24h内）的海马组织进行原代神经元细胞培养，鉴别神经元的纯度，观察孕期低剂量BDE-209暴露对窒息新生鼠海马神经元细胞形态学的影响。　　【材料与方法】　　1.购买12周龄SD雌性大鼠60只，雄性大鼠30只。将雌雄大鼠按2：1每3只合1笼，次日晨给雌鼠行阴道分泌物涂片检查，倒置显微镜下见雄鼠精子满视野为妊娠第0日,提出单独饲养，未孕则继续与雄鼠合笼，直到受孕。　　2. SD雌性大鼠自妊娠0天起随机分成每组10只，A组:空白对照（单纯花生油），B、C组：0.6、6 mg/kg BDE-209暴露组，D组:孕期窒息15分钟，E、F组:0.6、6 mg/kg BDE-209暴露+孕期窒息15分钟。B、C、E、F组雌鼠自妊娠第0天始，根据孕鼠体重按不同剂量将BDE-209溶解于2ml食用花生油中，每天下午避光胃灌1次，A、D组胃灌同量花生油以减少生理性差异，直至妊娠第21天（即孕22天）。　　3.窒息模型的建立：A、B、C组孕鼠行剖宫产术直接取出仔鼠，D、E、F组孕鼠行剖宫产将子宫血管完全夹闭15分钟后，取出仔鼠，迅速促使仔鼠恢复自主呼吸，制成孕期窒息模型。每只孕鼠随机抽取1只雄性仔鼠，每组共随机抽取10只雄性仔鼠，在产后24小时内取海马组织进行神经元的原代培养。　　4.培养7天后进行海马神经元细胞纯度鉴别。　　5.在倒置显微镜下观察海马神经元细胞的形态结构。　　6. MTT比色法检测神经元细胞的存活率。　　【结果】　　1.原代海马神经元细胞培养第7天观察神经元胞体清晰明亮，呈明显凸起状，周围晕光明显，胞核及核仁清晰可见，突起变粗变长并有分支，边缘清晰，形成明显的神经网络。　　2.免疫细胞化学法NeuN（神经元特异性烯醇化酶）鉴定神经元的经典方法。结果可见分散的海马神经元,神经元是主体,可占95%。　　3.倒置显微镜观察不同实验组神经元细胞形态，实验组可见神经元细胞胞体变小，变形，细胞膜完整但出现发泡现象，随着BDE-209浓度加大,可见神经细胞膜不完整，皱缩，空泡明显，在剂量相同情况下，孕期窒息导致神经元细胞形态损伤进一步加剧，大量细胞出现皱缩、变圆、脱落，突起缩短甚至消失，空泡增多。　　4. MTT比色法分析检测神经元的存活率，随浓度增加细胞存活率有不同程度的下降，高浓度BDE-209可明显降低海马神经元细胞存活率( P<0.05),孕期窒息能够进一步降低细胞存活率。　　【结论】　　孕期低剂量BDE-209暴露能够损伤新生鼠海马神经元细胞，使细胞形态发生改变，其损伤程度与剂量呈一定的正相关。随BDE-209浓度增加，细胞存活率有不同程度的下降，孕期窒息能够进一步损伤细胞形态，并降低细胞存活率，神经细胞形态学损伤和存活率下降导致神经系统损伤可能是其神经毒性作用机制之一。　　第二部分、孕期低剂量BDE-209暴露对窒息新生鼠海马丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响　　【目的】　　取12周龄SD雌性大鼠建立孕期低剂量BDE-209暴露后发生窒息的动物模型，观察新生鼠海马组织丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响。　　【材料与方法】　　1.购买12周龄SD雌性大鼠60只，雄性大鼠30只。将雌雄大鼠按2：1每3只合1笼，给雌鼠行阴道分泌物涂片检查，倒置显微镜下见雄鼠精子满视野为妊娠第0天,提出单独饲养，未孕则继续与雄鼠合笼，直到受孕。　　2. SD雌性大鼠自妊娠0天起随机分成每组10只，A组:空白对照（单纯花生油），B、C组：0.6、6 mg/kg BDE-209暴露组，D组:孕期窒息15分钟，E、F组:0.6、6 mg/kg BDE-209暴露+孕期窒息15分钟。B、C、E、F组雌鼠自妊娠第0天始，根据孕鼠体重按不同剂量将BDE-209溶解于2ml食用花生油中，每天下午避光胃灌1次，A、D组胃灌同量花生油以减少生理性差异，直至妊娠第21天（即孕22天）。　　3.窒息模型的建立：A、B、C组孕鼠行剖宫产术直接取出仔鼠，D、E、F组孕鼠行剖宫产将子宫血管完全夹闭15分钟后，取出仔鼠，迅速促使仔鼠恢复自主呼吸，制成孕期窒息模型。每只孕鼠随机抽取1只雄性仔鼠，每组共随机抽取10只雄性仔鼠，在产后24小时内取海马组织进行进一步检测。　　4.用酶标仪采用硫代巴比妥酸法测定各组仔鼠海马组织中丙二醛（MDA）含量。　　5.用酶标仪采用黄嘌呤氧化法测定各组仔鼠海马组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性。　　【结果】　　1.各实验组仔鼠MDA含量随BDE-209暴露剂量增加而增高，在BDE-209剂量相同的情况下，孕期窒息能够增加MDA含量，各组间两两比较，差异有统计学意义（F=11.14，P=0.000），析因分析结果表明BDE-209和孕期窒息之间无明显的交互作用(F=1.02，P=0.368)。　　2.各实验组仔鼠SOD活性随BDE-209剂量增加而降低，在BDE-209剂量相同的情况下，孕期窒息能够降低SOD活性。各组间两两比较，差异有统计学意义(F=28.227，P=0.000)。析因分析结果表明BDE-209和孕期窒息之间存在明显的交互作用(F=6.66，P=0.0026)。　　【结论】　　孕期低剂量的BDE-209暴露可抑制仔鼠海马SOD活性，促进MDA生成，出现氧化应激状态，与剂量呈一定的正相关。孕期低剂量BDE-209暴露和窒息之间存在一定的交互作用，氧化应激导致神经系统损伤可能是其神经毒性作用机制之一。　　第三部分、孕期低剂量BDE-209暴露对窒息新生鼠海马神经元细胞凋亡的影响　　【目的】　　12周龄SD雌性大鼠建立孕期低剂量BDE-209暴露后发生窒息的动物模型，取新生SD大鼠（24h内）的海马组织进行原代神经元细胞培养，用流式细胞仪检测孕期低剂量BDE-209暴露对新生鼠海马神经元细胞凋亡的影响。　　【材料与方法】　　1.购买12周龄SD雌性大鼠60只，雄性大鼠30只。将雌雄大鼠按2：1每3只合1笼，给雌鼠行阴道分泌物涂片检查，倒置显微镜下见雄鼠精子满视野为妊娠第0日,提出单独饲养，未孕则继续与雄鼠合笼，直到受孕。　　2. SD雌性大鼠自妊娠0天起随机分成每组10只，A组:空白对照（单纯花生油），B、C组：0.6、6 mg/kg BDE-209暴露组，D组:孕期窒息15分钟，E、F组:0.6、6 mg/kg BDE-209暴露+孕期窒息15分钟。B、C、E、F组雌鼠自妊娠第0天始，根据孕鼠体重按不同剂量将BDE-209溶解于2ml食用花生油中，每天下午避光胃灌1次，A、D组胃灌同量花生油以减少生理性差异，直至妊娠第21天（即孕22天）。　　3.窒息模型的建立：A、B、C组孕鼠行剖宫产术直接取出仔鼠，D、E、F组孕鼠行剖宫产将子宫血管完全夹闭15分钟后，取出仔鼠，迅速促使仔鼠恢复自主呼吸，制成孕期窒息模型。每只孕鼠随机抽取1只雄性仔鼠，每组共随机抽取10只雄性仔鼠，在产后24小时内取海马组织进行神经元的原代培养。　　4.采用流式细胞术Annexin V/PI检测海马神经细胞凋亡，每组设6个平行样品。　　【结果】　　A组海马神经细胞凋亡率为4.15％，B组、C组、D组、E组和F组细胞凋亡率分别为：17.94%，30.65%，8.17%，25.95%，39.03%。根据统计分析各实验组仔鼠海马神经细胞凋亡率随BDE-209暴露剂量增加而升高，在BDE-209剂量相同的情况下，孕期窒息能够增加海马神经细胞凋亡率，各组间两两比较，差异有统计学意义（F=337.85，P=0.000），析因分析结果表明BDE-209和孕期窒息之间有一定的交互作用(F=10.95，P=0.002)。　　【结论】　　孕期低剂量的BDE-209暴露可诱导新生鼠海马神经元细胞凋亡，其凋亡程度与剂量呈一定的正相关。在BDE-209剂量相同的情况下，孕期窒息能够促进海马神经元细胞凋亡。各组间两两比较，差异有统计学意义(F=337.85，P=0.000)。析因分析结果表明孕期低剂量BDE-209暴露和窒息之间存在一定的交互作用(F=10.95，P=0.002)。细胞凋亡导致神经系统损伤可能是其神经毒性作用机制之一。