肿瘤微环境中富含来源于免疫细胞和肿瘤细胞的丝氨酸蛋白酶,比如胰蛋白酶、类胰蛋白酶等,它们可以通过选择性地激活与G蛋白相偶联的蛋白酶活化受体-2 (Proteinase Activated Receptor 2, PAR2)促进肿瘤的发生和发展。PAR2广泛分布于体内外多种组织中,并在肿瘤,尤其是肺癌和结肠癌的发生和发展中发挥了重要的作用。本课题组前期研究发现PAR2表达增高与结肠癌淋巴结转移密切相关,然而到目前为止,PAR2调节细胞迁移的分子机制尚不明确。此外,miRNAs是一类重要的内源性单链非编码小RNA分子,在多种肿瘤组织中表达异常。niRNAs通过调节靶分子mRNA在体内发挥原癌或抑癌基因的作用,并参与肿瘤发生、发展、转移和侵袭过程。本论文探讨了miR-125b介导PAR2诱导肿瘤细胞迁移以及PAR2信号通路在调控miR-125b表达的分子机制。第一部分,我们首先在体外实验中证实PAR2活化在促进多种肿瘤细胞迁移的同时抑制了细胞内miR-125b的表达；而敲降PAR2不仅抑制了细胞迁移,而且上调细胞内miR-125b的表达水平。此外,过表达miR-125b可以阻断PAR2活化诱导的细胞迁移。接下来为寻找miR-125b的下游靶基因,我们利用miRNAs靶基因在线预测数据库检索了miR-125b下游靶基因,其中有124个基因与PAR2敲降结肠癌细胞全基因组表达谱芯片中相应基因的mRNA变化趋势相符。进一步缩小范围验证后发现：Gab2同时受miR-125b和PAR2双重调节。最后,利用双荧光素酶报告基因了Gab2是miR-125b的直接靶基因,并在体外证实miR-125b及其下游靶基因Gab2参与了PAR2诱导的肿瘤细胞迁移。为了探寻PAR2信号通路在肿瘤进展和转移中的作用,我们先后利用小鼠的结肠炎相关结肠癌模型及不同的肿瘤组织验证了PAR2、miR-125b和Gab2的表达与肿瘤浸润和转移的关系。首先我们利用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)成功建立小鼠结肠炎相关结肠癌模型。在该模型中可以依次观察到从增生向腺瘤、腺癌发展的病理过程,尤其是到了建模的晚期,小鼠结肠腺瘤突破基底层侵入粘膜下层形成腺癌。在此过程中,PAR2表达显著上升,而miR-125b表达则被抑制,Gab2在腺癌的表达也显著升高。另外,临床结直肠癌患者组织中PAR2与Gab2表达显著高于癌旁,miR-125b则相反,在伴有淋巴结转移的结肠癌病灶中PAR2、miR-125b及Gab2表达具有显著相关性。上述结果在卵巢癌样本及肺癌公共数据库中也得到了验证。第二部分,我们深入探讨了PAR2抑制miR-125b表达的分子机制。最新研究显示,乳腺癌中miR-125b启动子区CpG岛广泛的甲基化是其下调的主要原因。在本研究中,甲基转移酶抑制剂5’-aza-CR预处理细胞后可阻断PAR2诱导的miR-125b下调,但是针对DNA甲基化的MSP检测提示：PAR2活化并未引起pri-miR-125b1启动子区甲基化程度的明显变化。但是我们发现,敲降RNA甲基化转移酶Nsun2可以成功阻断PAR2对mi R-125b表达的抑制。进一步研究显示PAR2活化后增加了pre-miR-125b2腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰(N6-methyladenosine, m6A)。此外,敲降Nsun2不仅能阻断pre-miR-125b2的甲基化及成熟miR-125b表达的降低,还抑制PAR2介导的Gab2升高。这些结果提示PAR2下调miR-125b可能依赖于Nsun2相关的pre-miR-125b2甲基化修饰。综上所述,miR-125b及其下游靶基因Gab2介导了PAR2激活促进的肿瘤细胞迁移,而PAR2信号通路可能通过Nsun2依赖的pre-miR-125b2的m6A修饰而抑制miR-125b的表达。该发现从表观遗传学角度为解释微环境调节miRNAs促进肿瘤转移提供了新的证据。