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目的:1.通过单(左)侧输尿管结扎(UUO)建立小鼠体内肾纤维化模型,观察UUO纤维化肾组织Toll样受体通路及下游炎症因子的变化,探讨黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对肾纤维化程度和Toll样受体通路及下游炎症因子的影响。2.通过脂多糖(LPS)刺激人近曲小管上皮细胞(HK-2)建立体外炎症模型,观察LPS对细胞Toll样受体通路的激活作用及AS-Ⅳ对其的影响,探讨AS-Ⅳ对Toll样受体通路作用的环节。方法:1.UUO模型的建立和分组:将雄性C57BL/6小鼠50只随机均分为5组,即假手术组、模型组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组和黄芪甲苷高剂量组。模型组和黄芪甲苷处理组均用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,经左侧腹纵行切口行左输尿管结扎术,依次缝合肌肉层和皮肤层。术后小鼠按清洁级动物分笼喂养14 d。假手术组除模拟(不)结扎输尿管外,其余步骤与模型组和黄芪甲苷处理组相同。从手术当天黄芪甲苷低、中和高剂量组分别以10 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)和50 mg/(kg·d)的药物剂量灌胃给药14 d,假手术组和模型组灌胃给予等量含1‰乙醇双蒸水14 d。2.各组小鼠肾功能、肾纤维化程度、Toll样受体通路相关分子及通路下游炎症因子的检测:化学方法检测血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)反映肾功能改变。HE和MASSON染色观察肾组织形态学;MASSON染色观察肾组织胶原纤维沉积;免疫组化和western blot方法从蛋白水平以及reverse transcription-PCR从mRNA水平观察α-肌动蛋白(α-SMA)和纤维粘连蛋白(FN)表达;以此反映肾组织结构和纤维化程度的改变。免疫组化和western blot方法从蛋白水平以及reverse transcription-PCR方法从mRNA水平观察各组肾组织Toll样受体通路相关分子Toll样受体4(TLR4)、Toll样受体2(TLR2)、髓样分化因子88(MyD88)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、Toll样受体相关分子(TRAM)、TIR域含适配器诱导β-干扰素(TRIF)和核因子-κB(NF-κB)以及炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)表达的变化。3.LPS体外培养细胞炎症模型的建立和分组:HK-2细胞37℃、5%CO2细胞培养箱中用基础培养基(10%FBS和1%青链霉素的DMEM高糖培养基)培养,以50%细胞密度传代,24 h后细胞密度约达80%进行实验。通过设立含梯度浓度LPS的完全培养基(0.1%DMSO、10%FBS和1%青链霉素的DMEM高糖培养基)培养细胞,采用Cell counting kit-8(CCK-8)试剂盒检测OD值分析细胞活性状态以及western blot检测细胞炎症因子IFN-γ的表达,确定LPS 1μg/ml为体外细胞炎症模型建立成功的最佳剂量。将进行实验的HK-2细胞分为control组、LPS组、黄芪甲苷低剂量组(50μg/ml)、黄芪甲苷高剂量组(100μg/ml)和TAK-242组。各组同时分别加入相应培养基培养48 h,control组为完全培养基;LPS组为完全培养基+LPS 1μg/ml;黄芪甲苷低剂量组为完全培养基+LPS 1μg/ml+AS-Ⅳ 50μg/ml;黄芪甲苷高剂量组为完全培养基+LPS 1μg/ml+AS-Ⅳ 100μg/ml;TAK-242组为完全培养基+LPS1μg/ml+TLR4受体抑制剂TAK-242 5μM。4.各组培养细胞Toll样受体通路相关分子(TLR4、MyD88和TRAM)及炎症因子(IFN-γ)检测:western blot方法和reverse transcription-PCR方法观察各组细胞Toll样受体通路相关分子蛋白和mRNA以及炎症因子蛋白表达水平的变化。结果:1.黄芪甲苷对UUO小鼠肾功能、左(模拟结扎)肾组织结构和纤维化程度的影响:各组小鼠肾功能检测Scr和BUN差异均无统计学意义(P>0.05,下同)。假手术组小鼠肾HE染色显示组织结构正常;MASSON染色显示胶原纤维着蓝色,染色面积小,主要位于肾小管基底膜及管周围和肾间质;α-SMA和FN蛋白与mRNA均有表达,阳性染色区域着棕色主要位于肾间质。模型组小鼠患侧肾出现肾小球不同程度的萎缩甚至消失,明显的肾间质增宽;与假手术组比较,MASSON胶原纤维染色面积以及α-SMA和FN的蛋白与mRNA表达均明显增高,差异均具有统计学意义(P<0.05,下同)。黄芪甲苷低、中和高剂量组均出现不同程度的肾结构改变,与模型组比较肾间质水肿、肾小球萎缩和炎性细胞浸润等有明显改善。黄芪甲苷各组肾间质胶原沉积程度均较模型组减轻,α-SMA和FN蛋白表达均较模型组低;黄芪甲苷高剂量组和中剂量组肾组织α-SMA和FN分子mRNA表达水平较模型组低,黄芪甲苷低剂量组与模型组肾组织α-SMA和FN分子mRNA水平表达差异无统计学意义,与假手术组比较,黄芪甲苷高剂量组和中剂量组肾组织α-SMA和FN蛋白与mRNA表达差异不具有显著性,黄芪甲苷低剂量组肾组织α-SMA和FN蛋白和mRNA表达水平较假手术组高。2.黄芪甲苷对UUO小鼠肾组织Toll样受体通路相关分子及下游炎症因子的影响:假手术组小鼠肾组织内Toll样受体通路相关分子蛋白和mRNA均有表达。模型组小鼠肾组织MyD88依赖信号通路(TLR4、TLR2、MyD88、TRAF6和NF-κB)、MyD88非依赖信号通路(TLR4、TRAM、TRIF和NF-κB)的蛋白和mRNA表达量及下游炎症因子(IL-6、TNF-α和IFN-γ)分子的蛋白表达量较假手术组明显升高,差异均具有统计学意义。黄芪甲苷高剂量组肾组织Toll样受体通路相关分子的蛋白表达比模型组明显降低,与假手术组比较,TLR4、TLR2、MyD88、TRAF6、TRAM和NF-κB的蛋白表达均不具有显著性差异;Toll样受体通路相关分子的mRNA表达水平与模型组比较显著降低,与假手术组比较无差异。黄芪甲苷中剂量组肾组织Toll样受体通路相关分子的蛋白表达与模型组比较明显降低,与假手术组比较,TLR4、TLR2、TRAF6、TRAM和NF-κB的蛋白表达均无显著性差异;mRNA表达水平与模型组比较,Toll样受体通路相关分子的表达均呈降低趋势,TLR4、TRAF6、TRAM、TRIF和NF-κB分子的mRNA表达均明显低于模型组,与假手术组比较均无显著性差异。黄芪甲苷低剂量组肾组织Toll样受体通路相关分子的蛋白表达较模型组也呈降低趋势,TLR4、TLR2、MyD88和TRIF的蛋白表达低于模型组,但与假手术组比较,表达均明显高于假手术组;mRNA水平表达与模型组差异不具有显著性,与假手术组比,MyD88、TRAF6、TRAM、TRIF和NF-κB的mRNA表达无显著性差异。黄芪甲苷各组肾组织Toll通路下游炎症因子IL-6、TNF-α和IFN-γ蛋白表达明显较模型组低;与假手术组比较,高剂量组无统计学差异、中和低剂量组升高。3.各组体外培养HK-2细胞Toll样受体通路相关分子及炎症因子的变化:control组细胞TLR4、MyD88、TRAM蛋白和mRNA以及IFN-γ蛋白均有表达。LPS组细胞Toll样受体通路相关分子的蛋白和mRNA以及IFN-γ蛋白表达明显高于control组。TAK-242组为阳性对照组,与LPS组比较,TAK-242组细胞Toll样受体通路相关分子的蛋白和mRNA表达以及IFN-γ蛋白表达均显著性降低;与control组比较,TLR4、MyD88的蛋白和mRNA表达以及IFN-γ蛋白表达均无差异。与LPS组比较,黄芪甲苷高剂量组细胞Toll样受体通路相关分子蛋白和mRNA以及IFN-γ蛋白表达显著降低;黄芪甲苷低剂量组细胞Toll样受体通路相关分子蛋白和mRNA表达也呈降低趋势,TRAM、IFN-γ蛋白表达和Toll样受体通路相关分子mRNA表达均显著降低。与control组比较,黄芪甲苷高剂量组细胞TLR4、MyD88和IFN-γ分子的蛋白表达没有差异,Toll样受体通路相关分子的mRNA表达也无差异;同时黄芪甲苷低剂量组细胞的Toll样受体通路相关分子的蛋白和mRNA表达和IFN-γ分子的蛋白表达均无差异。与TAK-242组比较,黄芪甲苷低剂量组和黄芪甲苷高剂量组细胞Toll样受体通路相关分子和IFN-γ分子的蛋白和mRNA表达均无差异。结论:1.Toll样受体通路以及由此引起的炎症反应参与了小鼠UUO后肾纤维化过程。2.黄芪甲苷可抑制UUO小鼠纤维化肾组织Toll样受体通路及通路下游炎症因子的释放,减轻UUO小鼠肾纤维化程度。3.黄芪甲苷可抑制LPS对HK-2细胞Toll样受体通路分子表达的上调,抑制炎症反应。4.黄芪甲苷可能通过抑制肾组织细胞Toll样受体通路机制减轻炎症反应,改善小鼠UUO肾纤维化。