【摘 要】
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细胞色素P450(Cytochrome P450,P450,CYP)是人体主要的药物代谢酶,其中CYP2C9亚家族负责代谢约16%的目前临床常用药物,CYP2C9基因的高度多态性和其药物代谢的个体差异相关。C
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细胞色素P450(Cytochrome P450,P450,CYP)是人体主要的药物代谢酶,其中CYP2C9亚家族负责代谢约16%的目前临床常用药物,CYP2C9基因的高度多态性和其药物代谢的个体差异相关。CYP2C9*13突变体为本实验室首先发现的,为进一步研究此突变体对药物代谢的影响,及结构与功能的关系,我们用杆状病毒-昆虫细胞表达系统高效表达CYP2C9。在药物代谢过程中,P450酶需要NADPH-细胞色素P450氧化还原酶(CPR)作主要电子供体;而昆虫细胞表达体系中内源性的CPR不足以支持高量表达的P450对电子传递的需要,需外源添加。本论文利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统,建立了CYP2C9、CPR的Sf9昆虫细胞高表达体系。用廉价的聚乙烯亚胺(PEI)昆虫细胞的转染试剂成功取代了常用的昂贵的cellfectin;通过CO相差分光光度法测定了P450含量,表达量是COS体系的十倍以上;对酶粗液用兼性离子去污剂CHAPS处理,在体外重建了高效的P450-CPR电子传递膜体系。重组酶对底物药双氯芬酸的酶催化活力的测定结果,与本实验室COS细胞表达体系结果相吻合,说明已构建了正确的酶反应体系。本论文建立了CYP2C9、CPR的高活性、高表达量的昆虫细胞表达体系,有助于进一步研究CYP2C9*13突变体对药物代谢的影响。
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