胰岛是随机分布在胰腺中的细胞群,主要由α细胞,β细胞,δ细胞,PP细胞以及ε细胞这5种内分泌细胞类型组成。根据已往的研究我们知道胰岛α细胞主要分泌胰高血糖素,胰岛β细胞分泌胰岛素,胰岛δ细胞分泌生长抑素,胰岛PP细胞分泌胰多肽,胰岛ε细胞分泌生长素释放肽。这些细胞彼此间组成紧密精细的胰岛环路共同调控胰岛激素分泌,并且维持胰岛的正常生理功能及其自身的生长与存活。以往的研究发现,胰岛δ细胞分泌的生长抑素可以通过负反馈调控胰岛β细胞以及胰岛α细胞对胰高血糖素和胰岛素的分泌产生抑制作用。因此,生长抑素是胰岛环路中一种重要的激素,但是目前关于生长抑素分泌的调控机制仍旧研究的很少。尿皮质素3（urocortin3,UCN3）是一种在小鼠胰岛β细胞表达的肽激素,它特异性地通过2型促皮质激素释放激素受体（Corticotropin-releasing hormone receptor 2,CRHR2）发挥作用,小鼠胰岛中,CRHR2特异地在胰岛δ细胞中表达。已有研究发现UCN3由成熟的胰岛β细胞大量表达,并且UCN3可以作用于胰岛δ细胞膜上的CRHR2进而促进生长抑素的分泌,因此,UCN3可以通过旁分泌促进生长抑素的分泌从而激活胰岛细胞的负反馈循环功能,进一步使得胰高血糖素和胰岛素的分泌维持在一个正常稳定的水平。以上均表明UCN3是控制血糖稳定的一个重要激素,目前研究发现在糖尿病状态下,UCN3在胰岛β细胞中分泌减少,UCN3减少的这一变化反映了生长抑素介导的负反馈调节可能与糖尿病的病理机制研究相关。已有研究表明CRHR2可对多种组织器官的功能产生调节作用,例如调控脾脏B细胞的生活能力,血管的收缩能力,血压、子宫、肌肉的收缩性和神经元的兴奋性;也可以对免疫功能和有些神经内激素的分泌进行调节,例如对促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotropic hormone,ACTH）等的分泌进行调节。另外,CRHR2 是 G 蛋白偶联受体（Guanosine-binding protein coupled receptor,GPCR）,GPCR可以通过多种信号途径（例如G蛋白以及Arrestin）来激活下游信号转导从而产生多种功能。已知UCN3能够通过CRHR2促进生长抑素的分泌,但是现有的研究仅明确了个别分子（例如钙离子）可以影响UCN3对生长抑素的分泌,并且对其具体信号调控通路和产生的具体效应尚不清楚。因此我们创新研究的内容是UCN3刺激CRHR2后引起的生长抑素分泌的完整信号转导分子机制和作用。本研究中我们利用特异性标记胰岛δ细胞的病毒感染C57小鼠胰岛并通过流式细胞分选仪将胰岛δ细胞在无菌条件下分选出来,通过qRT-PCR技术检测UCN3刺激下胰岛δ细胞中G蛋白亚型和Arrestin亚型的表达变化。我们进一步使用两种糖尿病模型小鼠（STZ造模鼠以及NOD小鼠）,同样用病毒感染糖尿病小鼠胰岛通过流式分选出单细胞,使用qRT-PCR技术检测UCN3刺激下胰岛δ细胞中G蛋白亚型和Arrestin亚型表达情况,结果发现与对照组相比较Gs,Gq,G11,β-arrestin-1以及β-arrestin-2 mRNA水平皆有降低,因此,我们初步判断Gs,Gq,G11,β-arrestin-1以及β-arrestin-2都有可能对UCN3引起的生长抑素的分泌产生影响。然后我们通过构建相应基因敲除鼠,利用Somatostatin ELISA试剂盒分别检测 Gs,Gq,G11,β-arrestin-1 以及 β-arrestin-2 对 UCN3 引起的生长抑素分泌所做的贡献,然后结合细胞系实验,我们发现Gs,G11和β-arrestin-1都能参与调控UCN3通过CRHR2介导的胰岛δ细胞中生长抑素分泌水平。接下来我们深入研究了这三条分子通路是如何调控生长抑素分泌的具体机制。在探究Gs-cAMP通路中,我们发现UCN3信号被CRHR2接收并通过Gs蛋白传递给腺苷酸环化酶（AC）,然后上调第二信使cAMP信号,进而cAMP激活PKA使得CREB磷酸化,从而导致生长抑素分泌增加。Ryanodine受体（RyR）是一种钙离子释放通道,RyR有三种主要的亚型RyR1,RyR2,RyR3,它们在不同的组织中参与不同的信号传导途径,通过将钙离子从细胞器释放到胞内行使一系列的生物学功能。我们研究发现在Gs-cAMP通路中,RyR3能迅速地将钙离子从释放出来,从而将生长抑素分泌出去。在探究G11-PLC通路实验中,我们发现G11和Gq在胰岛δ细胞中的表达量有所差异,并且G11与CRHR2亲和力更大,同样我们的实验揭示了 UCN3信号被CRHR2接收后可以通过G11传递给下游PLC引起钙离子信号改变进而参与调控生长抑素的分泌水平。探究β-arrestin-1通路过程中我们得出结论,当UCN3持续激活CRHR2时,CRHR2会被快速磷酸化,并招募β-arrestin-1到磷酸化受体上形成复合物使CRHR2内吞,使得β-arrestin-1与胰岛δ细胞中表达量高的突触结合蛋白（Synaptotagmin,Syt）家族成员Synaptotagminl（Syt1）在囊泡里形成复合物进而参与生长抑素分泌调控。研究目的本论文研究的目的是通过建立在胰岛δ细胞中特异性敲除G蛋白的小鼠模型以及β-arrestin-1敲除鼠,深入研究UCN3通过CRHR2对胰岛δ细胞生长抑素分泌的调控作用及机制,然后结合糖尿病小鼠模型,通过多种生物学手段,研究胰岛生长抑素对胰岛稳态调控作用的分子机制以及生理方面的意义。研究方法1.检测UCN3刺激下特异性G蛋白亚型和Arrestin亚型对生长抑素分泌的影响。首先用UCN3长时程刺激C57小鼠胰岛,使用特异性标记胰岛δ细胞的病毒感染胰岛,然后通过流式细胞分选仪分选出胰岛δ细胞,通过qRT-PCR技术检测胰岛δ细胞中G蛋白亚型和Arrestin亚型mRNA的表达量变化,接着用UCN3长时程刺激STZ造模小鼠与NOD小鼠的胰岛,同样用特异性标记胰岛δ细胞的病毒进行感染,流式分选出δ细胞,qRT-PCR检测δ细胞中G蛋白亚型和Arrestin亚型的变化。接下来构建胰岛δ细胞Gs条件敲除小鼠,提取小鼠尾部基因组DNA,鉴定其小鼠基因型,在胰岛原代细胞阻断Gs（Gs敲除鼠）、Gq（Gq敲除鼠）、G11（加病毒敲低）、β-arrestin-1（敲除鼠）、β-arrestin-2（敲除鼠）,用ELISA试剂盒检测不同敲除小鼠胰岛在UCN3刺激下引起的生长抑素分泌水平的变化。2.检测Gs、PKA、RyR对UCN3诱导生长抑素分泌的贡献。首先在TGP52细胞中检测UCN3刺激后的cAMP变化,再通过Western Blot检测UCN3刺激后CREB磷酸化水平,接着在TGP52细胞中阻断cAMP、PKA、Gs后,使用ELISA试剂盒检测UCN3对生长抑素分泌的影响,进一步在Gs敲除鼠中,验证Gs对UCN3引起的生长抑素分泌的影响是否是通过Ryanodine受体以及在TGP52细胞中阻断RyR作用后,探究UCN3对生长抑素分泌的影响。3.检测G11-PLC介导的信号途径对UCN3诱导生长抑素分泌的贡献。在TGP52细胞中,在阻断G11、PLC后,用ELISA检测UCN3对生长抑素分泌的影响,然后使用qRT-PCR技术检测G11、Gq在胰岛原代δ细胞中的表达,接着进行BRET实验检测CRHR2分别与Gq、G11的亲和力,验证G11的作用。4.β-arrestin-1介导的信号途径在UCN3诱导生长抑素分泌的贡献。首先在TGP52细胞中,阻断β-arrestin-1后,通过ELISA实验检测UCN3对生长抑素分泌的影响,用qRT-PCR技术筛选在δ细胞中表达量高的且具有分泌功能的Synaptotagmin家族成员,再用ELISA实验检测β-arrestin-1和Synaptotagmin在UCN3对生长抑素分泌中的作用,通过Western Blot实验检测CRHR2、Synaptotagmin1与β-arrestin-1之间的相互作用。5.糖尿病模型鼠中UCN3对生长抑素的分泌的影响。将小鼠进行MLD-STZ造模后分离出胰岛,用UCN3刺激胰岛Omin,2min,5min,10min,20min,40min,60min之后ELISA实验检测生长抑素分泌水平,之后将MLD-STZ造模鼠δ细胞分选出来,通过qRT-PCR实验检测与生长抑素分泌相关基因的表达量的变化。研究结果1)在胰岛δ细胞中特异性敲除Gs基因,生长抑素分泌降低。Gs可以通过下游cAMP激活CREB磷酸化,并且可以通过RyR3通道释放钙离子将生长抑素分泌出去。2)G11和Gq在胰岛δ细胞中的表达量有差异,G11表达量高于Gq,并且G11与CRHR2亲和力高于Gq,用病毒特异性敲除胰岛δ细胞G11蛋白表现为生长抑素分泌降低,并且通过下游信号PLC起作用。3)通过敲除β-arrestin-1发现胰岛δ细胞生长抑素分泌降低,实验筛选出在δ细胞中表达量较高且与分泌有关的Synaptotagmin家族成员,发现β-arrestin-1能与Synaptotagmin1形成复合物参与生长抑素分泌调控。4)前面的实验研究已经发现δ细胞中UCN3通过CRHR2调控生长抑素分泌需要Gs,G11和β-arrestin-1共同参与,因此我们在不同造模情况下研究了 δ细胞中生长抑素的分泌情况,例如MLD-STZ造模,破坏了 G蛋白,β-arrestin-1及其下游信号通路蛋白,因此影响了 UCN3通过CRHR2对生长抑素分泌的调控,表现为破坏这三条信号通路后生长抑素分泌降低。结论胰岛δ细胞中UCN3通过CRHR2调控生长抑素分泌需要Gs,G11和β-arrestin-1三条信号通路共同参与调控。