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杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是第三纪孑遗植物,单科单属单种,在中国主要分布于四川、湖南、贵州等地区。杜仲药用成分主要为苯丙素类、环烯醚萜类、木脂素类等化合物,且木脂素类化合物中的松脂醇双葡萄糖苷具有双向调节血压功效。研究表明,Dirigent（DIR）蛋白在生物氧化酶或氧化剂的存在下,可以指导木质素单体偶联形成二聚体,进而参与木质素和木脂素分子的生物合成,并在响应生物和非生物胁迫因素诱导过程中有重要作用。因此,对DIR蛋白的功能进行研究具有重要的价值。本研究以实验室前期克隆得到EuDIR1蛋白编码基因为基础,对EuDIR1基因进行原核表达、同时进行遗传转化方面的研究,研究结果如下:1、EuDIR1基因原核表达及蛋白纯化本研究构建携带His标签原核表达载体pET-30a-EuDIR1和pMCSG19-EuDIR1,将原核表达载体分别转化表达宿主菌E.coli BL21（DE3）。结果显示,15℃下0.1 mmol/L IPTG诱导6 h后,蛋白的沉积量达到最高值,但其表达模式主要为包涵体。对包涵体进行纯化,收集目的蛋白,对其进行复性后,经Western Blot对His标签鉴定和蛋白质谱鉴定,获得可溶性且纯度较高的EuDIR1蛋白。2、EuDIR1蛋白体外功能分析为了研究EuDIR1蛋白的潜在“dirigent”活性,本研究在对照组中使用氧化剂过硫酸铵和O2催化底物E-松柏醇,进行氧化偶联反应,生成手性化合物。经手性柱HPLC（Chiralpak IB）分析,生成（+）-松脂醇和（-）-松脂醇的外消旋混合物,其中（+）-松脂醇含量为8.02μg/L。在实验组中,经氧化剂过硫酸铵和O2催化底物E-松柏醇后,加入EuDIR1蛋白,生成的产物与对照组相同,其中（+）-松脂醇含量为9.16μg/L。研究表明,在EuDIR1蛋白存在的情况下,E-松柏醇的氧化偶联优先形成（+）-松脂醇。同时,本研究证实EuDIR1蛋白对尖孢镰刀菌和污黑腐皮壳菌均有一定的抑制作用,且EuDIR1蛋白对尖孢镰刀菌和污黑腐皮壳菌的最小抑菌浓度分别为912.5和1825μg/mL。3、杜仲中EuDIR1基因表达量分析本研究构建植物过表达载体pSH737-35S-EuDIR1,通过热击法转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导的杜仲下胚轴转化法,经GUS组织化学染色和PCR验证,获得5株EuDIR1基因过表达杜仲组培苗。为研究EuDIR1基因在杜仲的表达水平,分别对EuDIR1基因过表达杜仲、转空载体杜仲和野生型杜仲的茎、叶和根中的EuDIR1基因的表达量进行测定。结果显示,EuDIR1基因过表达杜仲的茎、叶和根中的EuDIR1基因表达水平高于野生型杜仲。