蛋白质连接技术是生物科学研究中的重要的技术,弥补了传统方法化学连接法存在的制备工艺复杂,影响蛋白质活性的缺点。Soitase A酶是发现于革兰氏阳性菌中能够锚定表面蛋白到细胞表面的转肽酶,能够识别底物蛋白C端短肽序列LPXTG,与N端甘氨酸形成酰胺键连接到细胞表面。Sortase A酶由于介导这种高度特异性的连接,因而近期在生物技术领域受到高度关注,被广泛的应用于蛋白质与肽的连接、蛋白质与核酸的连接、蛋白质与糖类脂质的连接、蛋白质与化学官能团的连接、蛋白质的环化和活细胞标记等,连接产物在生化研究,蛋白质组学,生物医药方面发挥重要作用。对于Sortase A酶的深入研究,对其更好的应用有着重要的意义。本论文利用重组基因表达技术,成功制备来自金黄色葡萄球菌的S ortase A酶及其高活性突变酶,且纯度较高,每升大肠杆菌产酶量达30 mg,同时制备用于检测连接效率的底物蛋白GFP与生物素短肽,建立基于高活性Sortase A酶介导的蛋白质与生物素短肽连接的高效蛋白质连接体系。为了进一步开发此高效蛋白质连接体系的应用,以模式蛋白Spy-tag Catcher (SC)为例,制备得到纯度95%的Biotin-SC蛋白,成功将其定向固定于磁珠载体上,磁珠结合量为0.1μg/μL,证明此高效蛋白质连接体系可以成功应用,为后续更好更广泛的应用提供了范例。本论文中高活性Sortase A突变酶的获得以及高效蛋白质连接体系的建立,将不仅在蛋白质定向固定化领域发挥重要作用,也为将来在生物医药技术其他方面的应用奠定了坚实的基础。