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研究背景:非小细胞肺癌（Non small cell lung cancer,NSCLC）是世界范围内导致死亡的主要恶性肿瘤之一。基于含铂方案的联合化疗,直至数年前仍可说是晚期NSCLC患者的唯一治疗选项,然而其耐药的出现是限制结局改善程度的主要原因。外显子19的缺失突变（尤其是E746-A750删失）以及外显子21的氨基酸替代（密码子858处亮氨酸替代精氨酸,又称L858R突变）是两种最常见的EGFR激活性突变,也是赋予表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）治疗敏感性的最典型的两种突变。与EGFR为野生型（wild-type,WT）的患者相比,发生上述突变的NSCLC患者对EGFR-TKI治疗具有更高的响应率（response rates,RR）（高达70%）,且具有更长的中位生存期（长达24-30个月）。同野生型EGFR相比,上述突变导致EGFR的ATP结合口袋对EGFR-TKI的亲和力增加,因而使得NSCLC患者对EGFR-TKI治疗具有更高的敏感性。但由于继发性耐药的发生,其预后仍然不理想。双功能基因APE1在肿瘤治疗抵抗中具有重要作用,其DNA损伤修复活性受到其氧化还原（redox）状态的影响。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶（Apurinic aprimidinic endonuclease 1,APE1）又称为氧化还原因子（Redox factor-1,Ref-1）,它具有两个相对独立的功能域:C端的DNA修复功能域和N端的redox功能域。一方面,APE1是DNA碱基切除修复（base excision repair,BER）途径的核心修复酶,在脱嘌呤脱嘧啶（AP）位点的5’端切开DNA主链形成单链断裂（single strand break,SSB）,并对3’断端进行处理以利于DNA Polβ掺入正确的核苷酸。AP核酸内切酶活性为BER的成功修复所必需,而APE1提供细胞内超过95%的AP核酸内切酶活性。更为关键的是,APE1的修复底物AP位点的数量与DNA碱基损伤的程度直接对应,因此APE1是感知DNA碱基损伤的关键蛋白,其修复能力也直接反应DNA碱基损伤程度[1]。另一方面,APE1还具有redox活性可调控关键转录因子的DNA结合活性,包括NF-κB,AP-1,Egr-1,p53,HIF-1α等[3],以及我们最近发现的与线粒体功能相关的转录因子NRF1和TFAM[4]。在前期研究中我们发现肺癌、大肠癌、骨髓瘤、肝癌、骨肉瘤等肿瘤细胞中APE1均可被电离辐射诱导增加,通过敲低APE1则可显著提高肺癌等肿瘤细胞的抗肿瘤治疗敏感性[5]。目前多项研究证据支持APE1是肿瘤治疗敏感性的重要决定因子,是极具潜力的肿瘤治疗分子靶点[2]。基于DNA损伤和肿瘤治疗敏感性的关系,目前多数学者的观点认为APE1的DNA修复活性可能是参与肿瘤治疗敏感性调控的关键功能。我们前期研究发现AT-101联合EGFR-TKI药物明显抑制EGFR-TKI获得性耐药的NSCLC细胞的治疗抵抗,也发现AT-101可与脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶∕氧化还原因子（APE1/Ref-1）直接结合,从而抑制APE1的碱基切除修复和氧化还原活性[47]。因此,AT-101已被确认为APE1的双功能抑制剂。上述发现提示APE1可能在NSCLC EGFR-TKI获得性耐药中具有某种促进作用,抑制APE1及APE1氧化还原活性有可能克服NSCLC的EGFR-TKI获得性耐药。研究目的:我们前期研究发现APE1抑制剂AT-101联合EGFR-TKI可以明显改善获得性EGFR-TKI耐药NSCLC细胞的治疗抵抗。本文主要通过获得性EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞模型（HCC-827IR和PC-9ER）和固有耐药的细胞（NHI-H1975）以及HCC-827IR细胞移植瘤裸鼠模型,从体外和体内两个层次探讨APE1在NSCLC EGFR-TKI耐药中的作用及其机制,从而为临床相关试验提供实验室依据。研究方法:（1）给予EGFR-TKI获得性耐药细胞（HCC-827IR和PC-9ER）和固有耐药的细胞（NHI-H1975）一定剂量的APE1抑制剂AT-101、APE1 inhibitorⅢ或E3330以及Akt抑制剂MK2206联合EGFR-TKI（Icotinib和Erlotinib）处理;利用siRNA-APE1质粒进行细胞转染实验,调控细胞内APE1的表达水平,再联合EGFR-TKI药物（Icotinib和Erlotinib）处理;应用CCK-8实验和克隆形成实验检测细胞的增殖抑制水平,通过流式细胞仪检测药物处理后细胞的凋亡水平,免疫荧光激光共聚焦检测APE1的表达水平,Western blot检测APE1/Akt通路和凋亡相关蛋白的表达情况。（2）建立HCC-827IR细胞移植瘤裸鼠动物模型,给予AT-101联合Icotinib处理,测量移植瘤的体积和重量,Western blot实验和免疫组化实验检测移植瘤组织APE1/Akt通路和凋亡相关蛋白的表达情况。研究结果:（1）利用APE1的siRNA敲低APE1蛋白表达显著增强EGFR-TKI耐药细胞HCC-827IR、PC-9ER和NHI-H1975对EGFR-TKI（Icotinib和Erlotinib）的敏感性,并显著抑制EGFR-TKI诱导的p-Akt水平。（2）CCK-8实验和克隆增殖实验结果显示,相比单用EGFR-TKI药物,AT-101和EGFR-TKI（Icotinib和Erlotinib）药物的联合处理显著地抑制EGFR-TKI耐药细胞HCC-827IR、PC-9ER和NHI-H1975的生长;Western blot实验显示,AT-101的处理明显抑制EGFR-TKI诱导的p-Akt水平。（3）同样,CCK-8实验显示,APE1氧化还原活性抑制剂E3330与EGFR-TKI（Icotinib和Erlotinib）药物联合,有效克服HCC-827IR、PC-9ER细胞对EGFR-TKI的治疗抵抗,明显增强NHI-H1975对EGFR-TKI药物的敏感性;而APE1碱基切除修复活性抑制剂APE1 inhibitorⅢ联合EGFR-TKI药物对耐药细胞的增敏作用并不明显;Western blot实验显示,E3330对EGFR-TKI药物诱导的p-Akt水平的抑制较APE1inhibitorⅢ尤为明显。（4）因上述实验结果显示APE1可能通过激活Akt通路来参与EGFR-TKI耐药过程,我们联合了Akt抑制剂MK2206和EGFR-TKI（Icotinib和Erlotinib）药物。结果发现,此种联合明显增强HCC-827IR、PC-9ER和NHI-H1975细胞对EGFR-TKI药物的敏感性。（5）最后,建立HCC-827IR细胞移植瘤裸鼠模型,检验了上述体外实验结果。体内实验结果显示,给予AT-101联合Icotinib处理,明显抑制裸鼠移植瘤的生长速度、体积和重量;而且Western blot实验、免疫组化实验结果显示,AT-101明显抑制裸鼠移植瘤组织p-Akt水平,TUNEL凋亡检测显示,AT-101明显增强移植瘤组织的凋亡水平。