一、目的：近年来,国内外大量研究文献都表明氧化应激是许多病理因素造成心血管损伤的共同机制,在许多心血管疾病的病理过程中都有过量氧自由基产生,同时抗氧自由基防御机制却受到抑制,如动脉粥样硬化(AS)、高血压病、缺血性心脏病、高脂血症等。氧化应激损伤心肌细胞的转归与氧化应激的程度相关,在一定应激强度范围内,氧化应激对心肌细胞造成的损伤是可逆的,而超过一定限度,则对心肌细胞造成不可逆的损伤,主要包括心肌细胞的凋亡和坏死。原癌基因Pim(Proviral integration site of murine)家族是哺乳动物细胞中的丝/苏氨酸激酶,属于钙调蛋白依赖性的蛋白激酶,包括Pim-1、Pim-2和Pim-3。大量的实验研究已证实,Pim激酶的上调与细胞凋亡的抑制存在显著的相关性。Pim-2持续表达能够促进细胞长期抵抗各种凋亡信号的刺激。研究证实Pim-1在Akt通路中保护心肌细胞损伤,而在Pim-1缺失小鼠中Pim-2的表达增高了4.6倍；Pim-1缺失小鼠在心梗后7天,Pim-2的表达增高2.75倍。但Pim-2在心肌细胞中的表达及作用尚缺乏研究,有必要探讨Pim-2在心肌细胞损伤中的作用及机制。三七是具有多种心血管活性的中药,临床广泛应用于心血管疾病的防治。现代化学和药理学研究发现三七总皂苷(Panax notoginseng saponin, PNS)是三七的主要活性成分,含有多种单体皂苷主要有：人参皂苷Rb1,人参皂苷Rg1,三七皂苷R1。本课题以三七皂苷R1为研究对象,旨在了解三七皂苷R1对心肌细胞损伤的保护作用,并探讨其参与调节的细胞信号通路,凋亡相关蛋白,并了解其对Pim-2的调控作用。二、方法：1.乳鼠心肌细胞的原代培养外科无菌条件下取出乳鼠心脏,用胰酶40C过夜,终止消化,再用胶原酶消化液逐步消化法分离单个心肌细胞,接种至培养瓶中,采取差速贴壁分离法以去除心肌成纤维细胞,得到纯度较高的心肌细胞用于实验。2.H202致心肌细胞氧化应激模型建立心肌细胞正常培养2-3天后,选取细胞密度在80%-95%以上的,自律性搏动120～140次/min的心肌细胞用于实验,选取不同浓度与时间点的H2O2干预心肌细胞,选择合适的浓度及干预时间用于后续实验。3.三七皂苷R1预处理心肌细胞心肌细胞培养的第2-3天,细胞生长接近80%融合时,心肌细胞预先用不同浓度三七皂苷R1培养24h,进行三七皂苷R1毒性测试,选取合适的高、中、低剂量组进行相关后续实验。4.MTT比色法测定心肌细胞活力将心肌细胞接种于九十六孔板,按实验分组给予相应的处理因素后,按MTT法具体操作步骤进行操作,在酶标仪490nm处测其OD值并计算各组心肌细胞存活率。5.流式细胞术检测心肌细胞凋亡率心肌细胞按照实验分组处理后,用不含EDTA的胰酶消化收集,以Annexin V-FITC/Propidium Iodide进行染色,室温、避光、反应5～15min,上流式细胞仪(激发波长488nm,发射波长530mm)进行检测。6.心肌细胞LDH、MDA、SOD的检测将心肌细胞接种于六孔培养板中,按不同实验目的进行分组处理,处理完毕后,分别按照LDH、MDA、SOD检测试剂盒说明书进行操作,在酶标仪420nm处测量每组OD值并计算各组细胞内LDH、MDA、SOD的含量。实验重复三次以上。7.实时定量PCR检测心肌细胞内Pim-2mRNA的表达心肌细胞按照2×107/孔的浓度接种至六孔板中,取正常培养2-3天后状态最佳的心肌细胞用于实验。实验分组依次为：正常对照组、H2O20.5、1、2、3、6h五个时间组,50μMH2O2干预心肌细胞。用Trizol提取心肌细胞总RNA,在紫外分光光度计上测定OD260/OD280,鉴定提取的RNA纯度和浓度。然后,反转录合成cDNA,根据Gene Bank中Pim-2、GAPDH的基因序列资料,借助于计算机软件PrimerPremier5.0设计引物,上机进行目的基因的荧光定量检测。8. SiRNA沉默心肌细胞Pim-2基因调合适的细胞浓度分别接种于六孔板或九十六孔板中,正常培养2-3天左右,当贴璧细胞达到80%-90%融合时,取状态良好的细胞进行实验。siPORTTM NeoFXTM转染试剂与DMEM培养基混匀室温孵育15min, siRNA稀释液等体积混匀,孵育15min。然后将混合液加入培养板混匀。转染心肌细胞48-72h后收集细胞,再进行Western blot实验和流式细胞术检测心肌细胞凋亡率。9. Western blot法检测心肌细胞蛋白的表达心肌细胞按实验分组处理完成后,以Western及IP细胞裂解液提取心肌细胞蛋白,BCA法进行蛋白定量,进行蛋白印迹实验。以Actin为内参,将处理好的蛋白质样品进行SDS-PAGE分离,电泳结束后将蛋白质转移到PVDF膜上,封闭后,孵育一抗和二抗,ECL显色,KODAK Image Station2000MM成像系统采集图像,获得图像用图像处理软件Image Tool3.0测定并分析条带灰度值以检测目的蛋白的表达水平。10.统计分析实验数据采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料数据以x±s表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。若符合正态分布和方差齐性,则采用方差分析。若不符合正态分布和方差齐性,则采用秩和检验。方差齐性时两两比较采用LSD法,方差不齐时两两比较采用Tamhane’s T2法。多组计数资料的比较(各组AV评分)采用完全随机设计资料的Kruskal-Wallis检验方法。各实验组不同缺血及再灌注时间点血流动力学指标采用重复测量方差分析。检验显著性水准a=0.05。三、结果：1.三七皂苷R1对H2O2诱导的心肌细胞损伤的作用1.1H2O2对心肌细胞损伤的浓度效应关系MTT比色法检测不同浓度H2O2干预心肌细胞3h后,细胞活力显著降低,光镜下可看到细胞搏动减弱甚至停止,细胞密集区域出现大片细胞脱落。与正常对照组比较,H202干预的各组细胞活力均有所下降,经统计分析各组差异均有统计学意义(F=734.372,P<0.001),且随着H202浓度的增加各组细胞活力出现递减趋势。1.2不同浓度三七皂苷R1对心肌细胞活力的影响不同浓度三七皂苷R1预处理心肌细胞24h,比较各浓度三七皂苷R1作用后细胞活力与正常对照组的差异。经统计分析,三七皂苷R1浓度为0.1×10-6mol/L、1×10mol/L、10×10-6mol/L时细胞活力与正常对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05),而浓度为50×10-6mol/L、100×10-6mol/L时,作用心肌细胞24h后细胞活力较正常对照组显著降低(P<0.001)。1.3三七皂苷R1预处理对H2O2干预的心肌细胞活力的影响三七皂苷R1低、中、高浓度(0.1×10-6mol/L、1×10-6mol/L、10×10-6mol/L)预处理心肌细胞24h,然后以H2O2(50pmol/L)作用细胞3h,同时设立正常对照组、模型组,比较各不同浓度三七皂苷R1对H2O2诱导的心肌细胞活力的影响。经统计分析表明,各组间细胞活力差异有统计学意义((F=519.758,P<0.001)。三七皂苷R1预处理后可呈浓度依赖性减轻H2O2处理后心肌细胞活力的下降。1.4三七皂苷R1预处理对H2O2干预的心肌细胞凋亡率的影响流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡率,比较各不同浓度三七皂苷R1对H2O2诱导的心肌细胞凋亡率的影响。经三七皂苷R1预处理后,各组细胞凋亡与模型组相比有所减少,尤其是高浓度组的凋亡情况显著改善。经统计分析,各组差异均有统计学意义(P<0.0001)。1.5三七皂苷R1预处理对H2O2干预的心肌细胞LDH、MDA、SOD的影响试剂盒检测各组心肌细胞LDH、MDA、SOD值,结果与正常对照组比较,模型组心肌细胞SOD活性显著降低,而LDH活性、MDA含量则显著增加(P<0.001)；三七皂苷R1可呈剂量依赖性增加SOD活性,降低LDH活性、MDA含量,各组间比较差异具有统计学意义(P<0.001)。2三七皂苷R1对H2O2诱导的心肌细胞凋亡信号通路、凋亡相关蛋白表达的影响2.1三七皂苷R1预处理对H202干预的心肌细胞MAPK信号通路的影响2.1.1Western Blot检测各组细胞中P-ERK1/2.总ERK1/2蛋白表达的变化,分析目的条带的光密度值(IOD)。与正常组相比,模型组(H2O2) P-ERK1/2表达显著提高,三七皂苷R1低、中、高剂量组与模型组相比P-ERK1/2表达显著降低,其中高剂量组表达降低最为显著。各组间P-ERK1/2表达存在显著差异(P<0.01)。2.1.2Western Blot检测各组细胞中P-JNK、总JNK蛋白表达的变化,分析目的条带的光密度值(IOD)。与正常组相比,模型组(H2O2) P-JNK表达显著提高(P<0.001),三七皂苷R1低、中、高剂量组与模型组相比表达无显著差异(P>0.05)。2.1.3Western Blot检测各组细胞中P-P38、总P38蛋白表达的变化,分析目的条带的光密度值(IOD)。与正常组相比,模型组(H2O2) P-P38表达显著提高(P<0.001),三七皂苷R1低、中、高剂量组与模型组相比P-P38表达无统计学意义(P>0.05)。2.2三七皂苷R1预处理心肌细胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2表达的变化用Western Blot检测各组细胞中Box、Bcl-2蛋白表达的变化,分析目的条带的光密度值(IOD),正常组Bax、Bcl-2有一定量的表达,与正常组相比,模型组Bax表达显著增高,三七皂苷R1低、中、高剂量组与模型组相比表达逐渐降低(P<0.001)；与正常组相比,模型组Bcl-2表达量降低,三七皂苷R1低、中、高剂量组与模型组相比表达逐渐增高(P<0.001)。与正常组相比,模型组Bax/Bcl-2值显著增高,三七皂苷R1低、中、高剂量组与模型组相比表达逐渐降低(P<0.001)。3Pim-2在H202诱导的心肌细胞损伤中的表达及作用3.1H202显著上调心肌细胞内Pim-2mRNA的表达用浓度为50μmol/L的H202干预心肌细胞0.5、1、2、3、6h,实验设正常对照组。应用实时荧光定量PCR的方法检测各组心肌细胞内Pim-2mRNA的表达时发现,H202干预后的心肌细胞Pim-2mRNA的表达有所增加,各组差异有统计学意义(P<0.001)。其中H2O20.5、1h组与正常对照组相比,差异无统计学意义(P=0.056)；其余各浓度组与正常对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.001),尤其是H2023h组Pim-2mRNA的水平增加最显著；H2O26h组心肌细胞Pim-2mRNA表达水平有所降低,但仍高于正常对照组。3.2H202显著上调心肌细胞内Pim-2蛋白的表达应用Western blot法检测H202干预不同时间后心肌细胞内Pim-2的蛋白水平发现,H202干预后的心肌细胞Pim-2蛋白表达增高,其增高的趋势与实时荧光定量PCR检测出的Pim-2mRNA增高趋势一致,各组差异有统计学意义(P<0.001)。3.3Pim-2siRNA干扰对细胞凋亡的影响实验分为正常组,H202组,siRNA组(H2O2+siRNA),阴性对照组(H2O2+NC)。结果显示模型组与正常组相比,细胞凋亡率显著增加,siRNA干扰组细胞凋亡率进一步增加(P<0.001),阴性对照组与模型组相比无显著差异(P>0.05),与正常组相比显著增加(P<0.001)。3.4Pim-2siRNA干扰对细胞LDH、MDA、SOD的影响心肌细胞经Pim-2siRNA干扰后,心肌细胞SOD活性较模型组显著降低,而LDH、MDA含量较模型组显著增高,各指标组间差异具有统计学意义(P<.001),阴性对照组与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。4Pim-2蛋白表达调控4.1三七皂苷R1上调Pim-2蛋白的表达通过Western Blot技术检测各组心肌细胞Pim-2蛋白表达,结果显示模型组(H202)与正常组相比Pim-2表达显著增高,三七皂苷R1各剂量组Pim-2表达进一步增高,其中三七皂苷R1高剂量组表达增高最为显著,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。4.2Pim-2siRNA干扰对三七皂苷R1预处理心肌细胞凋亡率的影响实验分为正常组、模型组(H202)、三七皂苷R1组(H2O2+NG R110μM)、siRNA转染组(H2O2+NG R110μM+siRNA)、siRNA阴性对照组。流式细胞术检测各组细胞凋亡率,结果模型组与正常组相比凋亡率显著增高(P<0.001),三七皂苷R1组与模型组相比显著下降,siRNA组、siRNA阴性对照组与三七皂苷R1组相比无显著差异(P>0.05)。4.3Pim-2siRNA干扰对心肌细胞Bax/Bcl-2表达的影响实验分为正常组,H202组,siRNA组(H2O2+siRNA),阴性对照组。用WB检测各组细胞中Bax、 Bcl-2蛋白表达的变化,分析目的条带的光密度值(IOD),与正常组相比,模型组Bax表达显著增高,siRNA组与模型组相比表达进一步增高(P<0.01),阴性对照组与模型组相比Bax表达无显著差异。与正常组相比,模型组Bcl-2表达量降低,siRNA组与模型组相比表达进一步降低(P<0.0I),阴性对照组与模型组相比无显著差异。模型组与正常组相比,Bax/Bcl-2值显著增高,siRNA组进一步增高(P<0.01),阴性对照组无显著差异。四、结论：1、H202能抑制心肌细胞活力,促进心肌细胞凋亡的发生,导致氧化平衡体系的破坏。三七皂苷R1可以抑制H202诱导的心肌细胞损伤,增强心肌细胞活力,保护心肌细胞凋亡,增强细胞抗氧活酶活力。2、H202促进心肌细胞ERK、JNK、P38的磷酸化,三七皂苷R1下调H202干预的心肌细胞中ERK的磷酸化,而对JNK、P38的磷酸化无显著调控。三七皂苷R1下调H2O2干预的心肌细胞中Bax蛋白的表达,上调Bcl-2蛋白的表达。表明三七皂苷R1抗心肌细胞凋亡与调节ERK信号通路、凋亡相关蛋白有关。3、H202能诱导心肌细胞中Pim-2激酶的表达,Pim-2siRNA干扰可有效沉默Pim-2基因,Pim-2蛋白表达对心肌细胞损伤其保护作用。4、三七皂苷R1上调H202干预的心肌细胞中Pim-2的表达,但siRNA干扰Pim-2后,三七皂苷R1仍能抗心肌细胞凋亡,表明三七皂苷R1抗心肌细胞凋亡并非唯一通过Pim-2调控。Pim-2能调节H2O2干预的心肌细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。