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衰变发射正电子的18氟-氟代脱氧葡萄糖(18F–2–Deoxy–2–fluoro–D-glucose,18F-FDG)可以被代谢旺盛的恶性肿瘤优先摄取而在肿瘤部位浓聚,这种特性不仅可用于正电子发射计算机断层扫描(positron emission tomography,PET)进行恶性肿瘤的诊断和分期,而且可用于肿瘤靶向放射性治疗。目前,临床肿瘤放射治疗主要采用外照射放射治疗,但其会在射线杀伤肿瘤细胞的同时损伤周围正常细胞。因此,科学家一直在探索如何提高肿瘤放射治疗效果并同时降低射线对周围正常组织损伤的方法。研究证实,短半衰期的18F衰变,发射正电子,在组织内射程0.1-0.2mm,通过湮没辐射产生γ射线,不仅可进行PET显像,而且可以对高度摄取18F-FDG的恶性肿瘤进行放射治疗。近年来,肺癌发病率在全球范围内呈持续上升趋势,已成为目前全球发病率和死亡率最高的癌症之一。虽然治疗肺癌的方法非常多,但接受治疗的肺癌病人5年生存率仅为15%,故有必要寻找新的肺癌治疗方法。由于肺癌原发灶及转移灶可以高度选择性地摄取18F-FDG,肿瘤恶性程度越高,细胞代谢越旺盛,对18F-FDG的摄取率就越高,通过湮灭辐射产生的γ照射量就越大,治疗效果就越好。目的:本课题从细胞受照后形态变化、细胞增殖、细胞周期分布、活性氧产量、细胞凋亡及相关基因表达等方面,探讨不同放射性活度18F-FDG对Lewis肺癌细胞的影响,阐明18F-FDG诱导Lewis肺癌细胞凋亡的可能机制。为将来利用正电子放射性药物内照射治疗肺癌原发灶和转移灶提供实验依据。方法:( 1)细胞培养:将Lewis肺癌细胞接种于含15%小牛血清的RPMI 1640培养基中,37℃、5%CO2传代培养。(2)细胞照射:取对数生长期细胞,于传代24h后分别加入18F-FDG使其终放射性浓度为0、0.37×106、1.85×106、3.70×106、7.40×106Bq/ml,照后24h分别进行实验。(3)细胞形态观察取各照射组及对照组细胞后,普通倒置显微镜观察细胞形态变化,照相。透射电子显微镜观察:取各组细胞,以0.125%胰蛋白酶消化成单细胞,3000r/min离心,弃上清,PBS洗涤,40C预冷的2%戊二醛固定,PBS洗涤,1%锇酸固定,系列丙酮脱水包埋,制备超薄切片,醋酸、双氧铀及铅染液染色,透射电镜观察超微结构。(4)3H-TdR掺入:培养开始时加入1ml细胞密度为3.5×105/ml的细胞悬液、2.5ml RPMI1640培养液和放射性浓度为100uCi/ml的3H-TdR20ul,培养24h后,以0.125%胰蛋白酶消化细胞,滤膜法制样,液体闪烁法测定各样品的CPM值(每分钟脉冲计数)。( 5)细胞周期分布和凋亡率的检测:以0.125%胰蛋白酶消化、培养液制成单细胞悬液,计数活细胞并调整细胞放射性活度为3.5×105/ml。离心收集细胞,PBS洗涤,-20℃预冷的70%乙醇固定1h后,PBS洗涤,用5mg/mlRNA酶在37℃孵育30min,以10μg/ml碘化丙啶(Propidium iodide, PI)溶液染色,避光反应15min,上机检测。根据细胞中DNA含量,应用流式细胞仪分析G0/G1期、S期和G2/M期细胞所占的份额及凋亡率。( 6)细胞内过氧化氢的测定:18F-FDG处理细胞6h后,PBS洗涤2次,分别加入150μl 20μmol/L DCFH-DA工作液,在CO2培养箱内37℃孵育30min,PBS洗涤3次后,以流式细胞仪在激发光波长488 nm,发射光波长525nm处检测细胞荧光强度,每个样本计数10000个细胞,以WinMDI软件分析平均荧光强度(mean fluorescent intensity, MFI)。(7)丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量测定:取照后24h细胞,用0.125%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液,PBS洗涤2次,调整细胞密度为4×105/ml,反复冻融破碎细胞,离心,取各组细胞上清液,按试剂盒说明书测定丙二醛含量。细胞中蛋白含量测定用Bradford方法按试剂盒说明书进行操作。(8)细胞Bcl-2和Bax蛋白免疫组化鉴定:照射后,取对照组和照射组细胞,用0.125%胰酶消化后收集细胞,制细胞涂片。4℃丙酮固定30min,PBS洗3次,每次3 min。自然干燥后,染色过程严格按SABC试剂盒说明书操作,测定Bcl-2和Bax的表达,Bcl-2抗体的工作放射性活度1:50,生物素化单抗和SABC试剂的工作放射性活度均为1:100。用光镜在高倍镜下随机选择5个高倍视野,利用TD-2000型病理图像分析仪(北京天地电子科技公司产品)检测吸光度值,取平均值。(9)数据处理:所测数据用?x±s表示,采用单因素方差分析和q检验法进行比较。结果:(1)光学显微镜和透射电子显微镜观察到各实验组均出现典型的凋亡细胞,随着18F-FDG增加,凋亡细胞密度明显增加。(2)随着18F-FDG活度增大,细胞受照剂量增大,各照射组细胞CPM值与3H-TdR掺入率逐渐下降(p<0.01)。(3)对照组G0/G1峰前亚二倍体峰出现,照射组G0/G1峰前可见明显的亚二倍体峰,即凋亡峰,随着18F-FDG活度增加细胞凋亡率逐渐增加(p<0.01),处于细胞周期G2/M期的细胞比例也逐渐增大,表明细胞发生了G2期阻滞。同时,S期细胞的比例逐渐减小,G0/G1期细胞比例基本接近40%。对照组S期细胞比例为49.8%左右,表明细胞处于对数生长期。(4)不同放射性活度18F-FDG作用于LLC 24小时,受照细胞中过氧化氢含量均显著高于对照(p<0.01),且随着18F-FDG活度增大,照射量增加,细胞中过氧化氢含量逐渐增加。(5)18F-FDG作用于LLC 24小时,随着8F-FDG活度增加,Lewis肺癌细胞内MDA含量不断上升(p<0.01),表明细胞受照后脂质过氧化增加。(6)免疫组化结果显示Bcl-2蛋白和Bax蛋白主要分布在细胞质中,呈弥散的细小颗粒状,随18F-FDG放射性活度增加Bcl-2蛋白表达降低(F=9.33,p<0.01),Bax蛋白表达增强(F=21.32,p<0.01)。结论:18F-FDG照射能诱导Lewis肺癌细胞凋亡,且18F-FDG照射诱导Lewis肺癌细胞的凋亡率随放射性浓度增加而增加。