论文部分内容阅读
第一部分:粘着斑相关蛋白Kindlin-2在退变椎间盘组织的表达目的:检测粘着斑相关蛋白Kindlin-2在人不同退变程度髓核(Nucleus pulposus,NP)标本和不同年龄小鼠椎间盘(Intervertebral disc,IVD)中的表达,探究Kindlin-2的表达变化与椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IVDD)的相关性。方法:1.收集腰IVD突出病人的退变NP手术标本,根据病人术前MRI实行Pfirrmann分级,取II/III级为轻度退变组,IV/V级为重度退变组。对NP标本进行H/E和阿利新蓝染色进一步确定组织退变程度,进行粘着斑相关蛋白(Kindlin-1,2,3和Talin,Vinculin)免疫荧光染色检测其表达。2.对年轻小鼠(3月龄)和年老小鼠(20月龄)的腰IVD组织进行番红-固绿(Safranin O and fast green,SO&FG)染色和组织评分确定退变程度,进行上述粘着斑相关蛋白免疫荧光染色检测其表达。结果:1.在人退变NP标本中,H/E和阿利新蓝染色结果显示,重度退变组较轻度退变组NP细胞稀疏、细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)少;荧光染色显示Kindlin-1和Kindlin-3阳性细胞几乎没有,Talin和Vinculin阳性细胞较少,Kindlin-2阳性细胞较多且随着退变严重程度增加而减少。2.在小鼠IVD标本中,SO&FG染色和组织评分显示年老小鼠较年轻小鼠IVD发生严重退变;免疫荧光染色显示Kindlin-1和Kindlin-3在小鼠IVD组织中几乎不表达,Talin和Vinculin表达较少,Kindlin-2主要在NP组织中表达且随着小鼠年龄增加而显著减少。结论:上述结果说明粘着斑相关蛋白Kindlin-2主要在IVD中的NP组织表达,并且随着退变程度和年龄增加而减少,提示Kindlin-2的表达减少和IVDD相关。第二部分:条件性敲除Kindlin-2对小鼠椎间盘组织退变的影响目的:通过构建IVD特异性Kindlin-2敲除小鼠,探究Kindlin-2在IVDD中的作用。方法:1.通过多次交配繁育出Kindlin-2fl/fl;AggrecanCre ERT2小鼠,在小鼠2月龄的时候注射玉米油(对照组)或他莫昔芬(敲除组),在小鼠2、3、5、8月龄的时候对腰椎和尾椎进行计算机化断层显像(Computerized tomography,CT)扫描,在小鼠3、5、8月龄的时候取材,进行免疫荧光染色、TUNEL染色、SO&FG染色、组织评分和Western Blot分析。2.为进一步探究异常应力的参与作用,在Kindlin-2fl/fl;AggrecanCre ERT2小鼠注射玉米油或他莫昔芬4周后对小鼠尾IVD进行针刺造成尾椎不稳,在手术前(12周龄)和手术后6周(18周龄)对尾椎进行CT扫描,在18周龄的时候取材,进行免疫荧光染色、TUNEL染色、SO&FG染色和组织评分。结果:1.在小鼠腰IVD中,与对照组相比,免疫荧光染色显示敲除组在3、5、8月龄时,Kindlin-2表达显著降低,敲除效果较好;SO&FG染色和组织评分显示,敲除组在5月龄时组织评分明显高于对照组,8月龄时更加显著;染色和Western Blot结果表明,敲除组IVD内ECM合成分解失衡,表现为ECM合成相关蛋白II型胶原(Collagen type II,Col2)和蛋白聚糖(Aggrecan,Acan)表达减少,ECM分解相关蛋白基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13,Mmp13)和含血小板结合蛋白基序的解聚素金属蛋白酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif 5,Adamts5)表达升高;荧光染色、TUNEL染色和Western Blot结果表明,敲除组IVD内细胞凋亡增加,表现为Caspase3和Bax水平升高,Bcl2水平降低,TUNEL阳性细胞增加;CT结果显示,IVD的高度没有显著变化。2.在小鼠尾IVD中,免疫荧光染色也显示Kindlin-2敲除效果较好;但SO&FG染色、组织评分以及CT结果显示,敲除组和对照组的尾IVD没有显著差异。3.其他结果显示针刺造成的异常应力可导致对照组小鼠尾IVD组织评分增加、IVD高度降低、ECM合成分解失衡和凋亡增加,而在敲除组中这些变化更加显著。结论:上述结果说明Kindlin-2敲除可导致小鼠腰IVD发生自发性退行性改变,在尾IVD中则没有发生显著改变;Kindlin-2敲除可以加速异常应力存在下的小鼠尾椎间盘退变。这些结果提示Kindlin-2缺失在IVDD的发生以及进展中发挥重要作用,尤其是在异常应力存在的情况下。第三部分:Kindlin-2缺失引起椎间盘退变的机制研究目的:探究Nlrp3炎症小体信号通路是否参与Kindlin-2缺失引起的IVD细胞和组织退变。方法:1.运用免疫染色分别评估人不同退变程度NP标本和Kindlin-2敲除小鼠NP组织中Nlrp3炎症小体通路激活相关蛋白水平。2.在大鼠NP细胞系中,运用加压装置模拟椎间盘内的异常压力,并运用Kindlin-2 si RNA或Kindlin-2质粒分别敲低或过表达Kindlin-2,检测NP细胞中Nlrp3炎症小体通路和ECM合成分解相关蛋白的表达以及细胞凋亡情况。3.在IL-1β或(和)异常压力处理条件下,检测NP细胞中Nlrp3炎症小体通路相关蛋白和Kindlin-2水平。4.运用Nlrp3炎症小体通路激活抑制剂MCC950分别在体外和体内阻断Nlrp3炎症小体通路激活,检测MCC950对伴或不伴异常应力条件下Kindlin-2缺失造成NP细胞和IVD组织退变的挽救情况。结果:1.与轻度退变人NP标本相比,重度退变组Nlrp3炎症小体通路激活相关蛋白表达明显升高;与对照组比,Kindlin-2敲除组小鼠NP组织中Nlrp3炎症小体通路激活相关蛋白水平显著升高。2.异常压力导致Kindlin-2和Col2a1表达减少、Mmp13表达增多、细胞凋亡增加以及Nlrp3炎症小体通路激活,Kindlin-2敲低可加重这些变化,而Kindlin-2过表达则会改善这些变化。3.IL-1β可以浓度和时间依赖性的下调Kindlin-2和上调Nlrp3炎症小体通路激活相关蛋白的表达,异常压力可加重这些变化。4.在体外实验中,MCC950抑制了Kindlin-2敲低伴或不伴异常压力刺激造成的Nlrp3炎症小体通路激活、Col2a1表达减少、Mmp13表达增多以及细胞凋亡增加。5.在体内实验中,MCC950抑制了Kindlin-2敲除伴或不伴异常应力刺激造成的Nlrp3炎症小体通路激活、组织评分增加、椎间盘高度降低、Col2a1表达减少、Mmp13表达增多以及细胞凋亡增加。结论:上述结果表明Kindlin-2缺失可激活Nlrp3炎症小体通路,引起IVD细胞和组织退变。此外,激活的Nlrp3炎症小体可释放IL-1β,使得Kindlin-2表达下降和Nlrp3炎症小体通路进一步激活,形成Kindlin-2/Nlrp3炎症小体/IL-1β恶性循环轴,造成IVDD。第四部分:过表达Kindlin-2对椎间盘退变修复作用的研究目的:探究腺相关病毒介导的Kindlin-2过表达对压力诱导的人原代NP细胞退变和大鼠尾椎加压模型造成的IVDD的保护作用,初步评估Kindlin-2在IVDD治疗中的临床转化意义。方法:1.人原代NP细胞感染Kindlin-2或对照组腺相关病毒后,进行常压或异常压力处理,检测Kindlin-2,Nlrp3,Col2a1,Mmp13和IL-1β的表达以及细胞凋亡。2.SD大鼠(3月龄)分三组,包括假手术组、大鼠尾椎加压模型+对照腺相关病毒感染组、大鼠尾椎加压模型+Kindlin-2腺相关病毒感染组。在病毒感染3周后手术,手术2周后进行MRI评估和取材,以及SO&FG染色、组织评分、免疫荧光染色和TUNEL染色。结果:1.在人原代NP细胞内,腺相关病毒介导的Kindlin-2过表达部分抑制了异常压力造成的Kindlin-2表达降低、Nlrp3炎症小体通路激活、Col2a1表达减少、Mmp13表达增多以及细胞凋亡增加。2.在大鼠尾椎加压模型中,腺相关病毒介导的Kindlin-2过表达部分逆转录了异常压力造成的椎间盘T2加权信号降低、组织评分增加、Kindlin-2表达降低、Nlrp3炎症小体通路激活、Col2a1表达减少、Mmp13表达增多以及细胞凋亡增加。结论:上述结果表明腺相关病毒介导的Kindlin-2过表达对IVDD具有部分修复作用,Kindlin-2腺相关病毒在IVDD治疗中具有一定的临床转化价值。