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第一部分 Dnmt3b子宫条件性敲除对围植入期早孕小鼠子宫内膜功能的影响目的:胚胎植入是哺乳动物成功妊娠的关键环节,因此研究胚胎植入对解决自然怀孕和人工授精后出现的不良妊娠结局具有重要的指导意义。小鼠的胚胎植入依照时间顺序,包括2个关键环节:子宫内膜容受态的建立和子宫内膜的蜕膜化。首先,雌孕激素通过其核受体发挥作用,影响下游靶基因的表达和功能,共同作用促使子宫内膜进入容受态。其次,子宫内膜成功建立容受态之后,子宫基质细胞围绕侵入的胚胎发生增殖和分化转变为蜕膜细胞,这一过程称为子宫内膜的蜕膜化。胚胎植入过程中子宫内膜容受态建立失败和子宫内膜蜕膜化异常,都可能导致妊娠结局失败。已有研究报到了DNA甲基化对胚胎植入的影响,但具体的作用和作用机制尚未阐明。DNA甲基化受DNA甲基转移酶催化,且本课题组前期研究发现DNA甲基转移酶在早孕期小鼠子宫内膜呈规律性表达,因此本研究以DNA甲基转移酶3b(Dnmt3b)为切入点,探讨其对早孕期小鼠子宫内膜功能的影响,旨在阐明以下问题:(1)Dnmt3b是否影响围植入期早孕小鼠子宫内膜容受态的建立?(2)Dnmt3b是否影响围植入期早孕小鼠子宫内膜的蜕膜化?方法:(1)利用PRCRE-LOXP系统构建Dnmt3b子宫条件性敲除小鼠,基因型鉴定为Dnmt3blox P/lox P;PRCre/+的雌鼠为Dnmt3b子宫条件性敲除小鼠设为敲除组,基因型鉴定为Dnmt3blox P/lox P的雌鼠设为对照组。将敲除组和对照组雌鼠分别与6-8周龄正常C57BL/6J雄鼠交配后,采用免疫印迹和免疫组化方法检测两组雌鼠孕第5天(D5)子宫内膜Dnmt3b的表达,以确定Dnmt3b子宫条件性敲除小鼠模型是否构建成功。(2)采用免疫组化的方法检测敲除组卵巢Dnmt3b的表达;采用H&E染色方法检测敲除组和对照组卵巢的组织学形态;采用酶联免疫吸附测定方法检测敲除组和对照组血清雌孕激素水平。(3)采用繁殖实验,检测小鼠Dnmt3b子宫条件性敲除后对繁殖能力的影响。(4)检测小鼠Dnmt3b子宫条件性敲除后对子宫内膜容受态建立的影响:采用免疫印迹与免疫组化的方法,检测对照组和敲除组孕D4天子宫内膜容受态标志分子ERα、MUC1、PR的表达;采用尾静脉注射台盼蓝后肉眼观察并计数孕D5天胚胎着床点数量。(5)检测小鼠Dnmt3b子宫条件性敲除后对子宫内膜蜕膜化的影响:(1)肉眼观察并计数孕D7天胚胎着床点数量;(2)采用免疫印迹与免疫组化的方法,检测对照组和敲除组孕D5、D7天子宫内膜蜕膜化标志分子HOXA10、BMP2、MMP2、MMP9的表达;(3)采用H&E染色的方法,比较对照组和敲除组孕D7天子宫的组织学形态;(4)构建人工诱导蜕膜化模型,采用H&E染色方法,比较对照组和敲除组人工诱导蜕膜化后子宫内膜的组织学形态;采用免疫印迹和免疫组化的方法分析对照组和敲除组人工诱导蜕膜化后蜕膜化标志分子的表达。(6)利用Dnmt3b子宫条件性敲除小鼠模型,采用免疫印迹的方法检测小鼠孕D5、D7天肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT1A)的表达。结果:(1)Western blot和免疫组化结果显示,与对照组相比较,敲除组孕D5天小鼠子宫内膜Dnmt3b表达显著降低,提示Dnmt3b子宫条件性敲除小鼠模型构建成功。(2)与对照组相比,敲除组卵巢的Dnmt3b蛋白表达、卵巢的组织学形态、卵巢分泌的雌孕激素水平无显著差异。(3)Dnmt3b子宫条件性敲除后小鼠繁殖能力降低:与对照组相比,敲除组的每只产仔数、每只产窝数显著降低。(4)Dnmt3b子宫条件性敲除后,早孕小鼠子宫内膜容受态无显著改变:与对照组相比,敲除组孕D4天子宫内膜容受态标志分子MUC1表达无显著差异,ERα、PR的表达显著升高。对照组和敲除组的孕D5天着床点数量无显著差异。(5)Dnmt3b子宫条件性敲除后,早孕小鼠子宫内膜蜕膜化异常:(1)与对照组相比,敲除组孕D7天着床点数显著减少。(2)与对照组相比,敲除组孕D5天子宫内膜蜕膜化标志分子MMP9、BMP2、MMP2的表达显著降低;与对照组相比,敲除组孕D7天子宫内膜蜕膜化标志分子HOXA10、BMP2、MMP2的表达显著降低。(3)H&E染色结果显示敲除组孕D7天子宫的组织学形态异常,具体表现为:敲除鼠胚胎占子宫腔的面积比对照鼠的小;对照鼠的胚胎轴平行于系膜与系膜对侧的连线,而敲除鼠的胚胎轴不平行于这条连线,发生了一定角度的偏转。(4)人工诱导蜕膜化后,与对照组相比,敲除组蜕膜化诱导的成功率低及诱导侧子宫膨大的体积明显小。H&E染色结果显示,对照组蜕膜化诱导侧的子宫内膜结构致密而敲除组蜕膜化诱导侧的子宫内膜结构疏松;与对照组诱导侧相比,敲除组诱导侧大核细胞和多核细胞的数量明显减少,且核的直径也明显小。免疫印迹结果显示在对照组中,蜕膜化标志分子HOXA10和MMP2的表达诱导侧比对照侧显著升高;但在敲除组中,蜕膜化标志分子HOXA10和MMP2的表达诱导侧与对照侧无显著差异。免疫印迹结果显示与对照组诱导侧相比较,敲除组诱导侧HOXA10、MMP9、BMP2的阳性表达区域小且表达较弱。(6)Dnmt3b子宫条件性敲除后,小鼠孕D5、D7天CPT1A的表达紊乱。结论:Dnmt3b子宫条件性敲除后,子宫内膜蜕膜化异常,生育能力降低,生育能力降低可能是子宫内膜蜕膜化异常引起的。第二部分肉毒碱棕榈酰基转移酶1A在胚胎植入中的作用研究目的:蜕膜化是子宫内膜基质细胞转化为蜕膜细胞的过程。类固醇激素,生长因子,分子和表观遗传机制共同调节蜕膜化。蜕膜化是胚胎植入的关键步骤之一,因此挖掘更多的与蜕膜化相关的分子,有利于了解胚胎植入进一步有利于改善自然怀孕的结局。蜕膜化过程需要大量的能耗。葡萄糖代谢已被证明在蜕膜化过程中发挥重要作用。除了葡萄糖,脂肪酸也可以被许多细胞类型用作能量来源。脂肪酸主要通过脂肪酸β-氧化分解代谢产生乙酰辅酶A和ATP为细胞提供能量,而肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT1A)是脂肪酸β氧化的限速酶,且课题组前期基因芯片结果显示CPT1A在孕D5天着床点和着床旁差异表达,它有可能会参与小鼠子宫内膜蜕膜化,但关于CPT1A在围植入期早孕小鼠子宫内膜中的表达和作用尚未见报到,因此,本研究对CPT1A在围植入期小鼠子宫内膜的表达及其作用进行研究,阐明CPT1A在胚胎植入中的作用。方法:(1)采用免疫印迹技术检测CPT1A在妊娠小鼠孕D1、D4、D5、D6、D7天子宫内膜的表达。(2)采用免疫印迹和免疫组织化学技术检测CPT1A在孕D5、D6、D7天着床点和着床旁的表达。(3)构建人工诱导蜕膜化模型,采用免疫印迹和免疫组织化学技术检测CPT1A在人工诱导蜕膜化后的表达。(4)宫角注射Cpt1a-si RNA,采用免疫印迹技术检测CPT1A在干扰侧和Negative control对照侧的表达,并检测Negative control对照侧和Cpt1a-si RNA干扰侧孕D7天胚胎着床点数目。(5)采用免疫组织化学技术检测孕D7天蜕膜化标志分子BMP2在Negative control对照侧和Cpt1a-si RNA干扰侧的表达。结果:(1)免疫印迹结果显示CPT1A的表达孕D6、D7天比孕D1、D4、D5天显著升高。(2)免疫印迹结果显示与着床旁相比较,CPT1A的表达在着床点显著升高,免疫组化结果显示CPT1A在着床点的表达定位于基质的蜕膜区,在着床旁的表达定位于上皮,在基质未见表达。(3)免疫印迹和免疫组化结果显示CPT1A的表达在人工诱导蜕膜化后显著升高。(4)宫角注射Cpt1a-si RNA,CPT1A的表达显著下调,孕D7天胚胎着床点数目显著减少。(5)免疫组化结果显示与Negative control对照侧相比较,Cpt1a-si RNA干扰侧孕D7天蜕膜化标志分子BMP2的表达显著减弱。结论:CPT1A在胚胎植入过程中发挥重要作用,可能参与蜕膜化过程。