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葡萄风信子(Muscari spp.)是一种重要的观赏球根花卉。因其独特的蓝色色调和花型,被用于花园地被和家庭盆栽种植,也为研究蓝色花呈色机理提供了理想材料。葡萄风信子的花色形成主要依赖于类黄酮物质,特别是蓝色花青素衍生物。课题组前期研究推断葡萄风信子的二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)和黄酮醇合酶(FLS)基因可能通过调控花青素合成途径代谢通量共同调控蓝色花形成。本研究以蓝色葡萄风信子‘黑眼睛’(M.aucheri‘Dark Eyes’)为材料,对DFR和FLS基因调控葡萄风信子蓝色花形成机理进行研究,主要取得以下结果:(1)克隆得到两个DFR基因,分别命名为MaDFR(MK937098)和MaDFR1(KJ619964)。基因编码区全长均为1101 bp,编码366个氨基酸,蛋白质的分子量分别约为40.93 KDa和41.00 KDa;经氨基酸序列比对,两个蛋白同源性为97.27%。其中,MaDFR1和葡萄风信子‘白丽人’DFR序列同源性为100%。通过和其它物种已知功能的DFR蛋白序列比对发现,MaDFR和MaDFR1均具有保守的NADPH结合区域和底物特异性结合区域。聚类分析表明它们属于单子叶NADPH依赖性短链还原酶的二氢黄酮醇-4-还原酶家族。MaDFR和MaDFR1均定位于细胞质中,其转录表达具有组织特异性,尤其是在花中高表达,与飞燕草素的积累正相关。(2)体外原核表达及酶活分析表明,MaDFR和MaDFR1均具有催化二氢山奈酚(DHK)、二氢槲皮素(DHQ)和二氢杨梅素(DHM)生成相应无色花青苷的能力,并且,优先催化DHM生成无色的飞燕草素。此外,氨基酸点突变试验证实了底物结合特异区域中第135位的天门冬酰胺(N)和第146位的谷氨酸(E)决定着MaDFR和MaDFR1酶的底物催化活性。(3)通过农杆菌介导的叶盘法在模式植物烟草(Nicotiana tabacum‘NC89’)中过表达MaDFR(OE-MaDFR)和MaDFR1(OE-MaDFR1)。OE-MaDFR和OE-MaDFR1烟草花冠变成深红色。高效液相色谱(HPLC)方法定量分析,表明转基因植株中总花青苷的含量相对对照显著增加。此外,UPLC-Triple-TOF/MS质谱分析表明转基因植株中和对照株系中花青苷的种类相同,主要为矢车菊-3-芸香糖苷(Cy3R),无新物质生成。实时定量qPCR分析表明,OE-MaDFR1烟草花冠中,类黄酮3’5’羟化酶(F3’5’H)基因表达量较低,类黄酮生物合成途径的其它基因都上调表达,而OE-MaDFR烟草花冠中,上游结构基因查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)基因下调表达,这可能是受植物体内类黄酮途径的反馈机制影响。烟草中F3’5’H基因在转基因株系和野生型株系中维持较低本底水平,这可能也是在转基因株系中未能检测到飞燕草素(Dp)的原因之一。(4)利用染色体步移法克隆得到DFR基因上游调控序列,大小为1518 bp,顺式作用元件分析结果表明,该启动子含有重要的CAAT-box、TATA-box,花色相关的光响应元件、以及MYB和MYC类型转录因子结合元件。构建DFR启动子全长及不同缺失融合的GUS报告基因载体,转化农杆菌GV3101菌株并稳定遗传转化烟草,进行GUS组织化学染色分析和GUS转录表达分析。结果表明,DFR基因启动子只在烟草花冠中表达,且缺失-231 bp--407 bp后,GUS酶活活性显著减弱。双荧光素酶试验分析表明,转录因子MaMYBA与MaDFR启动子的-231 bp--407 bp区域结合。(5)采用RACE克隆技术获得MaFLS基因cDNA序列(MH636605),全长为1418bp。MaFLS基因编码区为993 bp,编码330个氨基酸,蛋白质分子量约为36.45 kDa。氨基酸序列比对和聚类分析表明,MaFLS具有保守的亚铁结合位点(His 216,Asp 218和His 272)和2-氧代戊二酸结合位点(Arg 282和Ser 284),属于可溶性Fe2+/2-ODD蛋白家族。此外,MaFLS具有潜在催化DHQ活性的高度保守结合位点,即五个关键氨基酸位点(Tyr 127,Phe 129,Lys 197,Phe 288,Ser 290),它还具有FLS特异性基序“PxxxIRxxxEQP”和“SxxTxLVP”。MaFLS转录表达具有组织特异性,在花发育的S1(刚形成花蕾期)和S2(花蕾刚开始着色)阶段表达,但是其表达与葡萄风信子中总黄酮醇的积累无关。(6)与野生型烟草粉色花相比,OE-MaFLS烟草株系花冠表现出不同程度的颜色变化:淡粉色至几乎白色、浅粉色和粉色。对比野生型株系,MaFLS转基因烟草花冠中花青苷的含量显著降低,而总黄酮醇的积累显著增加。qPCR分析表明,转基因烟草株系中的NtCHS,黄烷酮3羟化酶(NtF3H),NtDFR,花青素合成酶(NtANS)和烟草R2R3MYB转录因子(NtAN2)表达显著降低,NtFLS基因明显上调表达。综上所述,MaDFR通过优先催化二氢杨梅素导致代谢通量流向蓝色飞燕草素的生成;MaFLS通过与MaDFR竞争共同底物二氢黄酮醇生成黄酮醇类辅色物质。二者共同调控葡萄风信子的蓝色花发育。