糖尿病与脑缺血关系密切,二者患病率与日俱增,且机体在高血糖状态下,组织对缺血缺氧耐受性差,神经元不可再生、修复性低,加之脑组织本身结构的特殊性,以致脑缺血发生发展的环节复杂,修复的病理生理机制尚不明确。因此,深入研究糖尿病状态下脑缺血的病理生理特点,揭示缺血后适应的信号转导的调控机制,有针对性的拟定抗脑缺血的非药物保护策略,已成为当前基础与临床脑保护研究亟待解决的重要课题,也是本实验设计的关键所在。[目的]创建模型糖尿病及脑缺血模型,对糖尿病合并脑缺血模型实施缺血后适应处理。采用相关生化指标及病理形态学检测指标评估模型的成模情况以及缺血后适应对糖尿病脑缺血的作用。全面了解糖尿病、脑缺血及缺血后适应干预下差异表达基因的变化,分析探讨后适应对差异基因表达的调控和可能的脑保护机制,揭示后适应脑保护的信号通道及调控环节,旨在证实缺血后适应能通过有效激活机体内源性神经保护机制,以期为临床糖尿病患者缺血性脑卒中的防治提供一条新的保护途径,为临床全新治疗手段的研发开辟新的方向,为未来糖尿病慢性血管并发症“非药物治疗”策略的运用奠定坚实的理论基础和实验依据。[方法]本研究拟采用高脂喂养联合STZ腹腔注射构建低等灵长类动物—-树鼩糖尿病模型,以光化学诱导法建立皮层血栓性脑缺血,以缺血后4h作为实施缺血后适应的“时间窗”,通过周期性、反复夹闭缺血侧颈总动脉(夹闭5min,再通5min,重复3个循环)实施后适应处理;结合临床脑缺血发生发展的变化规律,以临床症状最突出的缺血后24h作为观察的时间点,通过血清生化指标检测了解机体代谢状态,采用TTC染色、HE染色及电镜超微结构观察对缺血性脑损伤进行全面的评价。并以缺血损伤变化最剧烈、最有代表性的缺血中心区域即缺血侧脑皮层作为观察对象,通过新一代高通量转录组测序技术,对糖尿病脑缺血树鼩转录组进行高通量测序研究,在转录组水平筛选验证不同实验组树鼩的相关差异表达基因,并结合生物信息学技术,进一步进行KEGG分析和GO分析,着重从NF-κB信号通路及TNF信号通路,探讨糖尿病及脑缺血时上述通路中相关因子的差异表达情况,以及经后适应处理过后的变化情况,以揭示缺血PC脑保护作用的分子机制。[结果]1.血生化指标变化:各组树鼩的体重(入组后体重)、血糖(入组后血糖)、胆红素、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、C反应蛋白均出现差异(P<0.05)。DM+脑缺血+缺血PC组与DM+脑缺血组相比,低密度脂蛋白胆固醇、C反应蛋白水平均有所下降(P<0.05),但仍较假手术组增高。2.TTC染色、HE染色、电镜超微结构检查结果均显示,缺血后24h照射区皮层可见明显的梗死灶;糖尿病使脑缺血组损伤加重、梗死灶的面积最大;经缺血后适应处理后,皮层梗死面积缩小,缺血损伤有所恢复,梗死面积的下降具有差异。3.差异基因分析结果显示:DM组和假手术组比较有769个差异表达基因(508个基因上调,261个基因下调),脑缺血组和假手术组比较有938个差异表达基因(732个基因上调,206个基因下调),DM+脑缺血组和DM组比较有2619个差异表达基因(1414个基因上调,1205个基因下调),DM+脑缺血组和脑缺血组比较有2206个差异表达基因(1118个基因上调,1088个基因下调),DM+脑缺血+缺血PC组和DM+脑缺血组比较有520个差异表达基因(203个基因上调,317个基因下调)。由于差异表达基因数量庞大,本结果仅分别列出上调及下调变化中表达倍数较大的前3个基因,即DM组与假手术组、脑缺血组与假手术组、DM+脑缺血组与DM组、DM+脑缺血组与脑缺血组以及DM+脑缺血+缺血PC组与DM+脑缺血组比较的差异基因。4.GO分析:DM+脑缺血+缺血PC组组和DM+脑缺血组差异基因GO分析比较上调差异基因的BP、CC和MF均无显著性差异,padj值均大于0.05。下调的BP主要在免疫系统过程(padj<0.05),主要参与的基因为受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 C(Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C,PTPRC)、TNF13、CXCL2和免疫应答(padj<0.05),主要参与的基因为C1QB、CCL5、CCAAT/增强子结合蛋白 δ(CCAAT/enhancer-binding protein delta,CEBPD);CC 没有显著性差异(padj>0.05);下调的MF主要在受体结合(padj<0.05),主要参与的基因为TNF14、C1QA、IL-6(IL6);肿瘤坏死因子受体结合(padj<0.05),主要参与的基因为C1QA、TNF14、TNF13、肿瘤坏死因子超家族受体结合(padj<0.05),主要参与的基因为C1QB、C1QC、TNF13、细胞因子受体结合(padj<0.05),主要参与的基因为TNF14、CXCL2、C1QA。5.KEGG分析结果显示DM+脑缺血+缺血PC组组和DM+脑缺血组比较上调基因的差异信号通路有0条(adj>0.05)(图47A)。下调基因的差异信号通路有13条(padj<0.05),分别为:NF-κB信号通路、TNF信号通路、Fcgamma R介导的吞噬作用。[结论]1.本研究采用高脂饲养联合STZ注射可诱导糖尿病以及联合光化学诱导的树鼩局部血栓性脑缺血模型,可较好地模拟临床2型糖尿病的发生发展的病理过程;对于揭示糖尿病脑缺血的发病规律以及病理生理机制具有重要的实用价值。2.缺血PC处理不仅可降低树鼩低密度脂蛋白胆固醇、C反应蛋白水平,并可减轻糖尿病树鼩皮层神经元的损伤而缩小脑梗死面积。3.研究发现树鼩脑缺血所致皮层神经元的损伤与C-C motif趋化因子介导的补体成分、CCL2、CCL4、IL-11、IL-8和TNF-α等多种因素有关,同时也是糖尿病加剧脑缺血神经元坏死及梗死面积扩大的关键所在。4.通过新一代高通量转录组测序技术的应用,率先从转录水平揭示树鼩脑缺血时高表达的炎症因子刺激了 NF-κB的活化,使NF-κB表达上调。而当合并糖尿病时,糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗等多种因素参与了 NF-κB信号的活化,形成炎症信号的正反馈,导致NF-κB过度激活进而导致TNF等其它不同的细胞信号通路被激活,进一步促进大量炎症因子的释放,是糖尿病及脑缺血时神经元水肿、凋亡及梗死面积扩大的重要因素。加重组织缺血损伤,使脑缺血损伤进一步加重,不同的细胞信号通路被激活5.在阐明树鼩糖尿病、糖尿病合并脑缺血后NF-κB和TNF信号通路以及C-C motif趋化因子在脑损伤分子机制的同时,证实缺血PC可有效下调NF-κB和TNF的信号通路,在转录水平上对糖尿病或脑缺血的神经元保护发挥调控作用,为未来临床糖尿病合并脑缺血时的非药物脑保护治疗提供了重要的实验及理论依据。无论是1型或2型糖尿病(T2DM),均是动脉硬化和脑血管病的重要独立危险因素。T2DM患者中大约20%～40%的可能并发脑血管病变,以缺血性脑血管病最为多见。其发病年龄较早、临床症状相对复杂且进展较快、并发症多,治疗相对棘手,临床疗效及预后差。由于缺乏基础与临床的结合以及基础研究向临床应用转化的探索,以致临床迄今尚无针对糖尿病血管并发症直接有效的靶向性治疗药物及手段。因此本文对T2DM患者缺血性脑血管病的发病特点和危险因素加以分析,并通过病例对照研究方法,以合并缺血性脑血管病为病例组,未并发缺血性脑血管病的患者为对照组,比较两组病例的各项血液生化检测指标及临床特征。采用回归分析方法对T2DM并发缺血性脑血管的相关因素进行探讨分析。[目的]更全面的了解T2DM并发缺血性脑血管病的相关危险因素,从而为T2DM患者中缺血性脑血管病的筛查和早期预防控制提供科学依据。在探索基础研究与临床实践相结合的可行性的同时,既有利于阐明T2DM患者机体不同的靶器官损害的病理生理机制,为未来精准控制危险因素,寻找有效的诊疗手段,促进基础研究向临床的转化提供可供借鉴的研究模式,具有重要的探索价值及应用意义。[方法]根据昆明医科大学第二附属医院内分泌科住院的T2DM患者的病历建立数据库,对T2DM患者缺血性脑血管病的分布特点和危险因素加以分析,并通过病例对照研究方法,以合并缺血性脑血管病为病例组,未并发缺血性脑血管病的患者为对照组,比较两组病例的各项血液生化检测指标及临床特征。采用回归分析方法对T2DM并发缺血性脑血管的相关因素进行探讨,分析T2DM并发缺血性脑血管病的相关危险因素。[结果]Logistic回归分析结果,采用Backward:LR法筛选变量,按0.05的纳入水准,0.1的剔除水准,进入模型的为:日常事务繁重程度、睡眠时间、高血压、高尿酸血症、高脂血症、动脉粥样硬化、颈动脉中内膜厚度、体重指数、糖化血红蛋白、刚性指数及纤维蛋白原,共11个变量,即此11个变量与缺血性脑血管病的发生有关。其中,睡眠时间、高尿酸血症、体重指数、抽烟回归系数均为负值,Exp(β)小于1,说明以上因素与T2DM患者并发缺血性脑血管病低风险相关。日常事务繁重程度、高血压、高脂血症、颈动脉中内膜厚度、糖化血红蛋白、刚性指数及纤维蛋白原,偏回归系数均为正值,Exp(β)大于1,说明以上因素与T2DM患者并发缺血性脑血管病高风险相关,是T2DM合并缺血性脑血管病发生的危险因素。[结论]1.不良生活方式诱发和加剧糖尿病相关的慢性并发症的发生发展,应早期干预。2.动脉内中膜增厚、高血压、高脂血症、HbA1C、刚性指数及Fib是T2DM合并缺血性脑血管病的高危因素。3.对T2DM患者缺血性脑血管并发症的筛查与防治应围绕上述危险因素精准控制。4.颈动脉彩超作为筛查动脉粥样硬化、动脉内中膜增厚及预测脑卒中发生的常规检查定期进行,对防范T2DM患者缺血性脑血管病的发生有重要意义。