研究背景：肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种进行性，致死的神经变性病，其中5-10％的病例为家族性肌萎缩侧索硬化(fALS)。1993年Rosen在fALS家族中发现了SOD1基因的错义突变是ALS研究中的一个重要里程碑，随后Gurney建立了突变SOD1的转基因小鼠模型。目前ALS尚缺乏有效的药物治疗，而干细胞移植可能是未来治愈ALS的希望。虽然干细胞移植在SOD1转基因小鼠的研究中已经取得了一些令人鼓舞的结果，但是还有一些关键问题需要解决。首先，移植细胞的选择还需要进一步研究。伦理问题限制了胚胎干细胞的应用。来源问题是神经干细胞最大的挑战。而由于容易获取，血液来源的干细胞包括脐带血干细胞和骨髓干细胞等成为治疗人类疾病较合适的选择。本研究中我们选择了人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)。在骨髓中作为营养细胞来支持造血干细胞的功能显示MSCs发挥神经保护作用的潜能。MSCs很容易从自体骨髓抽取物中安全大量获取，而且自体移植可以绕过免疫排斥问题。这些优势显示MSCs临床应用的巨大前景。第二，细胞移植的治疗机制还不清楚。功能性替代丢失的神经元非常困难，因此干细胞更可能是发挥了神经保护作用。研究显示活化的小胶质细胞及其产生的致炎细胞因子在SOD1小鼠疾病进展中起到重要作用。再者，应用COX-2抑制剂已经取得了令人鼓舞的结果，SOD1小鼠生存期能够延长20％。这提示小胶质细胞是一个有效的治疗靶点。然而小胶质细胞的作用是复杂的，它们即能起到神经保护作用，也可能是有害的，最后的结果可能依赖于小胶质细胞活化的强度以及与邻近神经元的相互作用。因此，抑制小胶质细胞活化也可能是有害的，但关键的问题是什么样的治疗能够操纵小胶质细胞，最小化它的神经毒性作用，最大化它对运动神经元的保护作用?MSCs能够产牛很多神经营养因子和细胞因子，一个非常重要的观察是环境能够影响这些因子的分泌。那么MSCs是否能够在炎症环境中根据需要来抑制小胶质细胞的活化?最后，理想的细胞移植途径仍不确定。ALS为弥漫性的神经变性病，因此局部注射细胞在临床上是不现实的。静脉移植细胞是最常选择的移植途径，但只有很少的细胞能够通过血脑屏障进入中枢神经系统实质。而鞘内注射是一种很有前景的移植途径，移植到脑脊液中的细胞能够绕过血脑屏障，可能会更容易迁移到病变的组织，但是研究结果还不一致。研究目的研究鞘内移植hMSCs是否对SOD1转基因小鼠有治疗作用；研究移植到脑脊液中的hMSCs能否通过脊髓软膜进入脊髓实质，识别一种更有效的移植途径；研究hMSCs是否能够抑制小胶质细胞的活化和炎症反应；进一步探讨MSCs抑制神经炎症的机制。 研究方法： 1体内 1.1动物模型首先雌性C57BL／6J小鼠与雄性SJL／J小鼠杂交，子一代为B6SJL。然后用雌性B6SJL小鼠与雄性SOD1-G93A转基因小鼠交配，应用PCR来鉴定子代鼠中SOD1-G93A转基因小鼠。雌性SOD1转基因小鼠随机分为：①hMSCs单次鞘内移植组(n=15)，在12周龄的小鼠鞘内移植hMSCs；②hMSCs多次鞘内移植组(n=25)，在12、14和16周龄的小鼠多次鞘内移植hMSCs；③PBS对照组(n=24)。同窝出生的野生型小鼠作为正常对照组(n=16)。 1.2 hMSCs的培养和鉴定从健康志愿者的髂骨嵴抽取2-10ml的骨髓，Ficoll梯度密度离心分离单核细胞。用流式细胞仪检测P4 hMSCs表面抗原CD34、CD44、CD29和CD45。取4代的hMSCs进行移植，细胞悬液的密度为100，000个／μ 1PBS，在移植前后用0.4％台盼兰检测细胞活性。 1.3鞘内移植小鼠用苯巴比妥麻醉，取俯卧位，颈部垫高使头部俯屈大约30o。缓慢注射5 μl的细胞悬液或PBS到枕大池。所有动物在手术前3天和之后给予环孢素A进行免疫抑制。 1.4评估疾病进展从第10周开始，每周监测小鼠疾病进展，包括临床观察、悬线试验、转棒试验和称重(单次移植组15只，多次移植组13只，PBS对照组12只，野生型对照组8只)。当小鼠连续2周显示运动缺损症状，回顾最早的时间即为临床发作时间。将小鼠身体翻转为仰卧位后，30秒内不能翻身为俯卧位的时间定义为死亡时间。 2体外试验 取出生1-2天的C57小鼠大脑原代培养混合的胶质细胞，应用摇动的方法来分离小胶质细胞。由于原代小胶质细胞培养困难，除了免疫荧光染色外，其它实验应用永生化的小胶质细胞系BV-2细胞。根据文献和LPS刺激BV-2细胞产生NO的浓度关系研究，我们选择1 μg／ml LPS刺激小胶质细胞活化。为了进一步探讨hMSCs抑制小胶质细胞活化的机制，应用RT—PCR来分析hMSCs在活化的BV-2细胞条件培养基中神经营养因子IGF-1、VEGF、BDNF、CTGF和TGF-α mRNA表达。 3统计分析存活资料应用Kaplan-Meier和Mantel-Cox分析。其它的资料应用单因素方差分析及Tukey事后检验分析。所有数值以均数±标准差表示。 结果： 1 hMSCs多次鞘内移植能够延缓SOD1小鼠疾病进展首先我们通过临床观察、称重和行为学试验评估各组小鼠疾病进展。与PBS对照组相比，在12周单次鞘内移植hMSCs对SOD1小鼠的疾病进展没有作用(此组资料不再显示)，但在12、14和16周多次鞘内移植hMSCs能够延迟SOD1小鼠疾病发作7天(约5％，P<0.05)，延长存活期16天(约9％，P<0.01)。与PBS对照组相比，从21周开始hMSCs多次移植组小鼠运动功能明显改善(P<0.05)，从22周起hMSCs多次移植能够明显减少SOD1小鼠体重丢失(P<0.05)。然后我们应用尼氏染色评估小鼠腰髓运动神经元数目。与PBS对照组相比，18周时(发病前)hMSCs多次移植组运动神经元数目没有明显差异(P>0.05)，21周(临床发作)时hMSCs多次移植组运动神经元(包括α和γ神经元)丢失明显减少(P<0.01)。 2鞘内移植的hMSCs不能通过脊髓软膜进入脊髓实质为了检测hMSCs在SOD1小鼠腰髓内的分布，我们应用入特异性抗HuNu抗体进行免疫荧光染色。第4代hMSCs种板24小时后进行免疫荧光染色，所有细胞均为HuNu免疫染色阳性。但是在21周的hMSCs多次移植的小鼠腰髓，我们没有探测至到HuNu免疫反应阳性的细胞，提示鞘内移植的hMSCs不能通过脊髓软膜进入脊髓实质。 3多次鞘内移植hMSCs能抑制胶质细胞的活化和炎症反应我们检查了hMSCs多次移植组和PBS对照组小鼠18、21周时腰髓胶质细胞的活化、p-p38MAPK和TNF—α水平。与PBS对照组相比，21周时抗CD11b和抗GFAP抗体的免疫荧光染色显示hMSCs移植组小鼠腰髓小胶质细胞活化和星形胶质细胞反应明显减轻；相一致的是，hMSCs移植组小鼠腰髓TNF—α和p—p38MAPK明显减少(P<0.01)。 4在体外，hMSCs抑制小胶质细胞活化为了证实鞘内移植hMSCs减轻炎症是由于减少了运动神经元的死亡还是由于减轻了神经炎症从而发挥神经保护作用，我们在体外检查了hMSCs对LPS诱导的小胶质细胞活化的作用。加入LPS12小时后，大多数原代小胶质细胞显示外形增大，F4／80免疫反应增强，而对照组小胶质细胞仍为圆形；相比之下，hMSCs混合共培养和transwell培养中的小胶质细胞大多数没有增大，而是保持静息状态的圆形，显示没有被充分活化。另外，与LPS对照组相比，hMSCs条件培养基对小胶质细胞的活化没有明显作用。与小胶质细胞形态学改变一致的是，在混合共培养和transwell培养时，hMSCs能够减少BV-2细胞释放NO、分泌TNF—α和p—p38MAPK蛋白的表达。MTT试验显示hMSCs共培养、transwell培养和hMSCs条件培养基培养对BV-2细胞活力没有影响。 最近一些研究显示神经营养因子能够减轻炎症，为了理解hMSCs抑制小胶质细胞活化的机制，我们检查了在炎症环境中hMSCs的神经营养因子mRNA表达。与对照组hMSCs相比，在炎症环境中中，hMSCs明显增加神经营养因子包括IGF-1、VEGF、BDNF、CTGF和TGF的mRNA表达(p<0.01)。 结论： 多次鞘内移植hMSCs能够延迟SOD1小鼠疾病进展，显示鞘内移植hMSCs是治疗ALS的有效方法；鞘内移植的hMSCs发挥神经保护作用不必进入中枢神经系统；hMSCs能够对炎症信号反应，然后通过分泌神经营养因子减轻神经炎症从而发挥神经保护作用。