【摘 要】
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我们构建了人血清白蛋白(human serum albumin HSA)与GM-CSF融合基因,即将HAS的C末端通过柔性接头5个甘氨酸及2个丝氨酸与GM-CSF的N末端相连接,融合的基因片段克隆至巴斯德毕
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我们构建了人血清白蛋白(human serum albumin HSA)与GM-CSF融合基因,即将HAS的C末端通过柔性接头5个甘氨酸及2个丝氨酸与GM-CSF的N末端相连接,融合的基因片段克隆至巴斯德毕赤酵载体pHIL-D2中.表达载体pHIL-D2/HAS/GM-CSF转化巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115,对14个转化子进行摇瓶诱导表达和培养物上清SDS-PAGE分析,结果筛选到了HAS/GM-CSF的高表达菌株.免疫印迹实验显示表达条带可与多克隆抗HAS抗体有很好的特异性反应,分子量与理论值相似,约为97KD.生物活性测定证明,融合蛋白HAS/GM-CSF能够刺激GM-CSF的依赖细胞株TF-1的生长存活;酶联免疫分析表明,HAS/GM-CSF能够与多克隆抗HAS抗体发生特异性反应;体外稳定性试验表明,融合蛋白HAS/GM-CSF在37℃小牛血清中存放60小时活性几乎不会降低,与同样条件下GM-CSF参照制品稳定期长约4倍.通过对摇瓶诱导条件优化,我们认为:3﹪甲醇量,起始菌密度为1×10<8>cells/ml,培基pH7,0.2﹪PEG6000诱导60小时可获得高表达量(100mg/L),并减少毕赤酵母表达系统对目的蛋白的降解.
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