目的:　　 一、观察海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊化卵巢细胞移植于去卵巢大鼠腹腔后对受体大鼠心功能直接或间接的影响。　　 二、观察微囊化卵巢细胞所分泌的雌激素对心肌ERα、ERβ、eNOS蛋白水平的表达的影响,获得其可能的心脏保护作用机制的信息。　　 材料与方法:　　 动物实验于 2008-03/2009-12在首都医科大学生殖医学研究中心完成。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。　　 将大鼠卵巢细胞进行体外培养,并应用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠生物膜包裹传至第2代的大鼠卵巢细胞。动物分组:实验将40只雌性wistar大鼠随机分为四组,每组各10只。正常对照组(CON group)；去卵巢组(OVX group):无菌条件下切除双侧卵巢；微囊移植组(T group):微囊培养24h后移植于卵巢摘除鼠的腹腔；雌激素替代治疗组(E2 group):腹腔注射乙烯雌酚0.2mg/kg,每3d注射一次。干预90d后处死。　　 一、使用碘[125I]雌二醇放射免疫分析药盒,放射免疫化学分析法测定各实验组中血清雌二醇(E2)变化情况。　　 二、血清学检测各实验组中血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白含量(LDL-C)。　　 三、超声心动图评价各实验组的大鼠心功能状态。　　 (一)M型超声心动图测量左心室舒张末期内径(LVIDd)和收缩末期内径(LVIDs),室间隔厚度(IVSd)和左心室后壁厚度(LVPWd),计算左心室舒张末期容积(LVVd)和收缩末期容积(LVVs)、左心室质量(LVM Cor)、左心室短轴缩短率(FS)以及射血分数(LVEF)。　　 (二)、脉冲多普勒测定舒张早期最大血流速度(E)和舒张晚期最大血流速度(A),等容舒张时间(IVRT),并计算E/A比值。　　 (三)、组织多普勒显像测定舒张早期二尖瓣运动速度(E’)和舒张晚期二尖瓣运动速度(A’),并计算E/A比值。　　 四、血流动力学评价各实验组的大鼠心功能状态。测定指标:左心室终末收缩压(LVESP)、左心室终末舒张压(LVEDP)、左心室内压最大上升速率(+dP/dtmax)、左心室内压最大下降速率(-dP/dtmax)　　 五、免疫组织化学技术观察各实验组心肌细胞中雌激素受体α(ER α)、雌激素受体β(ER β)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表达。　　 六、Western blotting法检测各实验组中心肌细胞中ERα、ER β、eNOS蛋白的表达。　　 七、酶组织化学法检测各实验组心肌细胞中三磷酸腺苷酶(ATPase)与琥珀酸脱氢酶(SDH)蛋白的表达与分布　　 结果:　　 一、血清雌二醇水平检测结果:去卵巢组血清雌二醇水平低于正常对照组、微囊移植组和雌激素替代治疗组,差异有统计学意义。而正常对照组、微囊移植组、雌激素替代治疗组之间差异无统计学意义。　　 二、血清血脂指标检测结果:大鼠双侧卵巢摘除90d后,雌激素持续缺乏的大鼠OVX组与CON组相比,血清中TC、TG、LDL-C 水平显著升高,HDL-C水平显著降低；卵巢摘除后长期补充人工合成雌激素(乙烯雌酚0.2mg/kg/3d)(E2 group)90d后,TC、HDL-C 水平恢复至正常水平,TG、LDL-C 水平仍然较高显著升高；而微囊化卵巢细胞移植(T group),TC、TG、HDL-C和LDL-C水平均恢复正常,与CON 组比差异无统计学意义。　　 三、超声心动图检测结果　　 (一)M型超声心动图检测结果:去卵巢组与正常对照组比较,IVSd、LVPWd、LVIDd、LVIDs、LVVd、LVVs、LVM Cor均显著增加,LVEF、FS减低,差异有统计学意义(p<0.05)。而微囊移植组与去卵巢组相比明显改善,各参数均与正常对照组接近,差异无统计学意义。雌激素替代治疗组与去卵巢组相比有一定改善,其中IVSd、LVPWd与正常对照组接近,差异无统计学意义,但LVIDd、LVIDs、LVVd、LVVs、LVM Cor仍有一定增加,LVEF、FS减低,与正常对照组相比差异有统计学意义。　　 (二)心尖四腔切面二尖瓣血流速度频谱检测结果:使用脉冲多普勒可以清晰显示大鼠二尖瓣血流速度频谱。检测结果显示,去卵巢组与正常对照组比较,E和E/A比值降低,A增高,IVRT 延长,差异有统计学意义(p<0.05)。而微囊移植组与去卵巢组相比明显改善,各参数均与正常对照组接近,差异无统计学意义(p>0.05)。雌激素替代治疗组与去卵巢组相比有一定改善,其中E和E/A比值升高,A、IVRT 减低,差异有统计学意义(p<0.05)。但上述参数与正常对照组相比差异仍有统计学意义。　　 (三)组织多普勒显像记录二尖瓣运动速度检测结果:去卵巢组与正常对照组比较,E’、E/A降低,E’峰低于A峰,差异有统计学意义(p<0.05)。而微囊移植后有显著的效果,与去卵巢组相比,各参数均与正常对照组接近,差异无统计学意义(p>0.05)。而雌激素替代治疗组与去卵巢组相比差异无统计学意义(p>0.05),与正常对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)。　　 四、血流动力学检测结果:与正常对照组相比,大鼠去卵巢后,表现出左心室收缩与舒张功能明显减低。LVESP、LVEDP、+dP/dtmax、-dP/dtmax 均有不同程度的改变,其中LVESP、+dP/dtmax 分别较正常对照组显著降低,LVEDP、-dP/dtmax 则显著升高(p<0.05)。卵巢摘除后长期补充人工合成雌激素虽有一定改善,但与正常对照组比较差异仍有统计学意义(p<0.05)。微囊化卵巢细胞移植后心功能明显改善,与去卵巢组相比,各参数均与正常对照组接近,差异无统计学意义(p>0.05)。且各参数均显著高于雌激素替代治疗组。所有数据中反映收缩功能的指标LVESP和+dP/dtmax二者的变化趋势一致,而反映舒张功能的指标LVEDP和-dP/dtmax变化趋势一致。　　 五、免疫组织化学技术标记心肌细胞中 ERα、ER β、eNOS 蛋白的检测结果:正常大鼠心脏组织中ERα免疫反应阳性物质呈棕黄色着色,圆形或椭圆形,存在于心肌细胞、血管壁细胞的胞核中,胞质未见明显的阳性着色。ER β免疫反应阳性物质呈棕黄色着色,存在于心肌细胞的细胞质中。eNOS免疫反应阳性物质呈棕黄色着色,存在于心肌细胞、血管壁细胞的胞浆中。大鼠双侧卵巢摘除90d后,雌激素缺乏的大鼠OVX组与CON组相比,心脏的ERα、ERβ和eNOS 免疫反应阳性细胞数较正常对照组明显减少,染色强度显著下降(p<0.01)。卵巢摘除后长期补充人工合成雌激素(乙烯雌酚0.2mg/kg/3d)90d,与OVX组相比,心脏的ER β、eNOS免疫反应阳胞数及染色强度没有显著变化,ERα免疫反应阳胞数有所增加,染色强度有一定加强。大鼠双侧卵巢摘除进行微囊化卵巢细胞移植90d后,心脏的ERα、ER β和eNOS 免疫反应阳胞数及染色强度与雌激素缺乏的OVX组相比均显著增加(p<0.01)。　　 六、采用 Western Blot 法检测大鼠心肌组织中ERα、ERβ、eNOS蛋白表达的结果:大鼠双侧卵巢摘除90d后,雌激素缺乏的大鼠OVX组与CON组相比,心脏的ERα、ERβ、eNOS 蛋白水平显著减少(p<0.01),卵巢摘除后长期补充人工合成雌激素(乙烯雌酚0.2mg/kg/3d)90d后,与OVX组相比,心脏的ERα蛋白水平有所增加,但与CON组比较差异仍有统计学意义(p<0.05)；ERβ、eNOS蛋白水平没有增加而是下降了。大鼠双侧卵巢摘除进行微囊化卵巢细胞移植90d后,心脏的ERα、ERβ、eNOS蛋白水平与雌激素缺乏的OVX组相比均显著增加(p<0.01)。　　 七、细胞化学染色技术检测结果:正常大鼠心肌细胞线粒体和细胞膜中ATPase 活性部位呈棕黑色。SDH 活性部位呈蓝紫色沉淀。大鼠双侧卵巢摘除90d后,雌激素缺乏的大鼠OVX组与CON组相比,心肌细胞中ATPase与SDH染色强度显著下降(p<0.01)。卵巢摘除后补充雌激素90d,与OVX组相比,心脏的ATPase与SDH 染色强度有一定增强。大鼠双侧卵巢摘除进行微囊化卵巢细胞移植90d后,心脏的ATPase与SDH染色强度与雌激素缺乏的OVX组相比均显著增加(p<0.01)。　　 结论　　 1.本实验将微囊化大鼠卵巢细胞移植入去卵巢大鼠的腹腔,微囊能够保持分泌激素的生物活性。囊内卵巢细胞所分泌雌激素可透过微囊膜并明显提高去卵巢大鼠的雌激素水平。　　 2.微囊化大鼠卵巢细胞所分泌的雌激素起到了内源性雌激素的作用,改善了去卵巢大鼠心脏的收缩与舒张功能。　　 3.微囊化大鼠卵巢细胞所分泌的雌激素能够增量调节ERα和ERβ的表达,并增量调节其下游的靶基因eNOS蛋白水平的表达,这可能是微囊化卵巢细胞移植保护心功能的机制之一。　　 4.微囊化大鼠卵巢细胞所分泌的雌激素能够通过改善去卵巢雌性大鼠的血脂间接实现对心功能的保护作用。并能够增量调节ATPase和SDH的表达,增加心肌供能供氧量,改善心功能。