【摘 要】
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目的传统研究T细胞功能的方法是制作条件性基因敲除小鼠,此方法费时费力。本研究通过制作CRISPR/Cas9条件性敲入小鼠,将此小鼠与CD4Cre小鼠杂交,使得Cas9基因在小鼠T细胞中特异性表达。构建针对不同目的基因的sg RNA表达载体,然后包装成逆转录病毒（MSCV）并感染活化的T细胞,实现了在小鼠T细胞中快速敲除目的基因的试验体系。运用此试验体系,在小鼠CD8+T细胞中快速敲除表达丰度高的长
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目的传统研究T细胞功能的方法是制作条件性基因敲除小鼠,此方法费时费力。本研究通过制作CRISPR/Cas9条件性敲入小鼠,将此小鼠与CD4Cre小鼠杂交,使得Cas9基因在小鼠T细胞中特异性表达。构建针对不同目的基因的sg RNA表达载体,然后包装成逆转录病毒（MSCV）并感染活化的T细胞,实现了在小鼠T细胞中快速敲除目的基因的试验体系。运用此试验体系,在小鼠CD8+T细胞中快速敲除表达丰度高的长链非编码RNA（lnc RNA）,研究这些lnc RNA在CD8+T细胞中的功能。方法1.CRISPR-Cas9条件性基因敲入小鼠的制作:设计CAG启动子驱动的Cas9表达载体,在启动子和Cas9编码框之间插入3x转录终止序列,终止序列两端分别带有loxp序列。将此序列构建到含有Rosa26同源臂的打靶载体。委托公司制作基因敲入小鼠。2.T细胞条件性表达Cas9小鼠品系的繁育:将CD4Cre小鼠与Cas9+/-小鼠杂交获得CD4Cre+Cas9+/-小鼠,将CD4Cre+Cas9+/-于Cas9+/-杂交获得CD4Cre+Cas9+/+小鼠。3.sgRNA载体构建:根据目的基因外显子设计其对应的sg RNAs,对其进行克隆并与酶切后的MSCV-sg RNA-U6-PGK-BFP载体连接,转化,小提质粒、测序,挑选sg RNA和酶切后MSCV-sg RNA-U6-PGK-BFP连接无误的克隆进行中提。4.病毒包装及T细胞转导:通过转染试剂lip2000将表达载体分别转染至BOSC细胞中,48h后感染活化的Cre+Cas9+/+T细胞,培养48h后用流式细胞仪检测该方法对目的基因的敲除效率。5.RNA seq:使用流式细胞仪对活化的T细胞进行分选,然后对分选的CD8+T细胞使用第三代测序技术进行转录组测序。6.Real time RT-PCR检测基因表达:分别收获活化0h,24h,48h后的CD8+T细胞,提取RNA,然后使用实时定量RT-PCR检测目的基因的表达。7.流式细胞术检测表型:对T细胞进行表面及胞内染色,然后使用流式细胞仪对这些细胞进行包括活化、细胞因子产生、增殖及凋亡等表型分析。结果1.成功构建CRISPR-Cas9条件性敲入小鼠。2.使用来源于此小鼠的T细胞,成功建立了在体外快速敲除目标基因的试验体系。3.通过RNA测序发现包括AW112010和Zfas1在内的少数lnc RNA丰度较高。4.运用CRISPR/Cas9体系敲除小鼠原代T细胞上的Zfas1基因,CD8+T细胞凋亡增加。结论LncRNA Zfas1调控CD8+T细胞凋亡。
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