Duchenne型肌营养不良症(Duchenne musculardystrophy，DMD)是一种以骨骼肌进行性变性、坏死为主要病理特征的致死性X-性连锁隐性遗传性肌肉疾病。此病发病率高，为活男婴的1/3500。患者常于2～5岁隐袭起病，12岁左右丧失行走功能，20～30岁时因呼吸、循环衰竭而死亡。DMD像许多其他肌肉疾病一样，晚期损害都不仅仅局限于肌肉，还涉及了神经系统，引起疼痛、烧灼感、瘙痒、感觉异常、麻木、肌肉无力、甚至瘫痪等症状。因此，在诊断和治疗肌肉病变的同时，我们也要考虑神经病变的因素。血脑屏障的存在影响了治疗药物和因子自外周组织进入神经系统。因此，寻找一种能够有效地将治疗药物和基因传递入病变的神经系统以缓解症状的载体显得非常重要。人们曾尝试绕过血脑屏障，直接将基因或基因载体注入脑脊液中，使其迅速、有效地到达病变部位。但此法破坏血脑屏障，并容易造成注射部位局部的损害。近年，寻找能够通过血脑屏障的基因载体以及能够逆向转运的基因载体，将治疗药物和基因带入神经系统，成为了这个领域的研究焦点。　　 目的：选择腺相关病毒作为载体，分别将myostatin的抑制剂follistatin蛋白的基因作为治疗基因，LacZ基因作为标记基因装入载体。在构建pBSKS-follistatin后，转染正常小鼠的C2C12细胞，观察其分化后的myoblast的形态变化，将含有follistatin、LacZ基因的腺相关病毒通过腹腔和肌肉注射递送入正常ICR小鼠，然后分别检测follistatin在体内的表达以及其对小鼠的体重、肌肉重量、肌纤维形态和大小、运动功能的影响和AAV载体对注射部位周围的肌肉组织、周围神经，脊髓背根神经节、脊髓神经元轴突、脊髓神经元以及雪旺氏细胞的转染情况，为最终应用于临床提供实验依据。　　 方法：　　 ⑴取正常ICR小鼠双侧卵巢，用Trizol法提取RNA，逆转录为cDNA后，以此cDNA为模板，forward和reversed两端DNA序列为引物，进行小鼠follistain基因的PCR扩增，跑胶鉴定后回收目的片段。　　 ⑵用T4连接酶将上述回收片段与pBSKS载体相连2～4小时后，行电转化，在琼脂平板上培养14～16个小时后用碱裂解法小量制备质粒DNA，然后进行酶切鉴定和序列分析排除基因突变。　　 ⑶以p BSKS-mouse-follistatin质粒为模板，p BSKS-m-follistatin-SacⅠ和pBSKS-m-follistatin-XhoⅠ为引物进行含SacⅠ和XhoⅠ酶切位点的小鼠follistatin的PCR扩增，行DNA沉淀后回收目的片段。　　 ⑷先构建含有小鼠follistatin基因和LacZ基因的腺相关病毒质粒Pxx-cag-mouse-follistatin和PEMBL-cmv-LacZ，酶切鉴定和序列分析后，挑选正确的质粒行大量制备，然后对大量制备后的质粒进行酶切鉴定和序列分析。　　 ⑸当40盘接种于25cm2平板上的293细胞培养至75～80％融合时，分别将Pxx-cag-mouse-follistatin、pHelper和AAV9以及PEMBL-cmv-LacZ、pHelper和AAV8按3∶4∶1的比例转染细胞，培养7～16小时后换液，48～72小时后收集病毒行PEG8000纯化，然后用dot-blot的方法测定病毒浓度。　　 ⑹当接种于10cm2平板上的C2C12细胞长至50～60％融合时，用纯化后的表达质粒Pxx-cag-mouse-follistatin经LipofectamineTM试剂盒转染C2C12细胞。1.5小时后，换含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养24小时后，换为含2％胎牛血清的DMEM高糖培养基促进成肌分化。5～7天后行desmin免疫荧光染色观察成肌分化的情况。　　 ⑺分为AAV9-cag-mouse-follistatin新生鼠腹腔注射组和对照组、AAV9-cag-mouse-follistatin成年鼠肌肉注射组和对照组、AAV8-cmv-LacZ新生鼠腹腔注射组和对照组以及AAV8-cmv-LacZ成年鼠肌肉注射组和对照组8组。　　 ⑻注射8周后，麻醉、断颈、去皮，比较不同组鼠的胫前肌、腓肠肌、股四头肌、肱三头肌、膈肌和心肌的重量。　　 ⑼使用自动握力检测仪、rota rod机和机动Treadmill机对AAV9-cag-mouse-follistatin新生鼠腹腔注射组和对照组小鼠的上肢握力、下肢肌力和平衡功能以及整体心肺功能进行测定。　　 ⑽根据检测需要分别取AAV8-cmv-LacZ注射组和对照组小鼠的脊髓做冰冻切片，用抗β半乳糖苷酶抗体和抗神经元胞体抗体合染，荧光显微镜观察后拍照。　　 ⑾根据检测需要分别取AAV8-cmv-LacZ注射组和对照组小鼠的周围神经(坐骨神经和腓神经)做冰冻切片，用抗β半乳糖苷酶抗体和抗髓鞘基蛋白抗体合染，荧光显微镜观察后拍照。　　 ⑿应用SPSS13.0分析软件进行统计分析。小鼠的体重、肌肉重量、肌纤维横截面半径和运动功能的所有数值以均数±标准差表示，根据不同数据进行单因素方差分析或t检验，显著性检验水准为α=0.05。　　 结果：　　 ①构建了含小鼠follistatin和LacZ的重组表达核酸质粒和重组腺病毒。测定后的AAV9-cag-mouse-follistatin和AAV8-cmv-LacZ病毒的浓度分别为2×1012v.g./ml和2.5×1012v.g./ml。　　 ②真核表达质粒Pxx-cag-mouse-follistatin通过质脂体转染到C2C12细胞后，提高了C2C12细胞的分化率，同时使成肌分化后的C2C12细胞明显增粗。　　 ③研究结果表明AAV9能够介导小鼠follistatin蛋白在全身骨骼肌肌肉细胞内表达，使小鼠体重较对照组增加17.9％，且以骨骼肌肌肉组织的重量增加(较对照组增加了89～156％)为主而非其他组织的重量(如心肌和脂肪等)。注射组小鼠肌肉组织增生和肥大并存，但以肥大为主，而且增大的肌肉细胞均为有功能的细胞，它们能够使小鼠的上肢握力、下肢的肌力和平衡功能分别较对照组增强了约58％和90％。　　 ④研究结果表明肌肉注射AAV9能够介导小鼠follistatin蛋白在被注射肌肉细胞内表达，使注射组小鼠肌肉明显较对照组增大，肌肉重量增加(较对照组增加了126～180％)，且肌肉组织增生和肥大并存，但以肥大为主，这与新生鼠腹腔注射后的实验结果是一致的。　　 ⑤研究结果表明AAV8能够介导LacZ蛋白在进入神经系统，并在脊髓、脊髓背根神经节和周围神经中表达。而且，脊髓白质中的LacZ阳性细胞较灰质中多，下段脊髓的LacZ阳性细胞较上段多。这说明AAV8能够通过腹腔注射进入神经系统；离注射部位越近的地方，基因表达越高；且AAV8对白质的感染效率大于灰质。　　 ⑥研究结果表明AAV8能够介导LacZ蛋白进入神经系统，并在注射侧的肌肉、脊髓、脑干、脊髓背根神经节和周围神经中表达；脊髓和脑干白质中的LacZ阳性细胞较灰质中多；离注射点越近的脊髓，LacZ阳性细胞越多；注射后时间越长，发现LacZ阳性细胞的部位离注射点越远。这说明AAV8能够通过肌肉注射进入神经系统，而且很有可能是通过逆向转运的机制进入神经系统的。　　 ⑦成年小鼠的脊髓神经元胞体、周围神经系统中的神经元轴突和髓鞘均能被AAV8转染。　　 结论：　　 ⑴携带小鼠follistatin基因的腺相关病毒载体可以有效转染C2C12细胞，促进其成肌分化。　　 ⑵新生ICR鼠腹腔注射AAV9-cag-mouse-follistatin能够使注射组小鼠体重增加、肌肉重量增加、肌纤维横截面半径增加和运动功能增强。　　 ⑶成年ICR鼠肌肉注射AAV9-cag-mouse-follistatin能够使注射组小鼠肌肉重量增加和肌纤维横截面半径增加。　　 ⑷AAV8-cmv-LacZ能够转染小鼠的注射侧肌肉、周围神经、脊髓背根神经节、脊髓和脑。白质中LacZ阳性细胞较灰质多；离注射点越近，LacZ阳性细胞越多；注射后时间越长，发现LacZ阳性细胞的部位离注射点越远。证明AAV8很有可能是通过逆向转运进入神经系统。　　 ⑸AAV8-cmv-LacZ能够转染小鼠的脊髓神经元胞体、周围神经中的轴突和雪旺氏细胞。