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研究目的:分子伴侣热休克蛋白90(Heat shock protein90,HSP90)作为热休克蛋白家族成员之一,在肿瘤细胞的存活过程中有非常重要的作用,是肿瘤治疗的一个有效靶点。研究放射性131I标记17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamy-cin,17-AAG)在体内、外生物活性分析,探讨核素标记HSP90抑制剂对人非小细胞肺癌靶向治疗潜力。
研究方法:1.H460、A549、SPC-A-1三种非小细胞肺癌及EC-304正常人内皮细胞培养扩增后,间接细胞免疫荧光染色和western blot分析观测三种非小细胞肺癌细胞上HSP90表达情况,以正常EC-304细胞作对照;加入不同浓度17-AAG(0、15、30、60、120 nM)干预细胞,计算存活细胞率和72h半数抑制率(IC50),比较不同细胞株对药物的敏感性。2.双氧水法制备131I(125I)-17-AAG,观察放射性标记探针体外稳定性和生物活性,放射性受体-配体饱和实验测定125I标记17-AAG与不同细胞株结合的平衡解离常数(Kd)和最大结合位点容量(Bmax);MTT法比较四种给药方式对细胞生长抑制作用,包括17-AAG(1μg)、Na131I(740kBq)、131I-17-AAG(185 kBq、370 kBq、740 kBq和1480kBq)、和17-AAG(1μg)+131I-17-AAG(740kBq)联合给药,并用流式细胞术分析对细胞凋亡率和细胞周期变化的影响。3.荷H460非小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤模型建立。体内分布实验:24只荷瘤鼠分间质注射或尾静脉注射131I-17-AAG(每只1.85MBq/0.1mL),分别于0.5h、4h、24h和1w处死,取血和主要组织脏器测放射性计数率值;体内显像实验:12只荷瘤鼠随机分为4组(n=3),包括131I-17-AAG间质给药组、静脉给药组、Na131I间质给药对照组及竞争性显像组,放射性给药剂量为每只5.55MBq,0.1mL,并且竞争性显像组提前2h予未标记17-AAG200μg,行SPECT显像观察;治疗实验:28只荷瘤裸鼠随机分为7组(n=4),间质和尾静脉注药各3组,剂量依序为5.5MBq×2、11.0MBq和5.5MBq,另设空白对照组。观察16d后处死,做光镜、电镜及免疫组化检测;Western blot检测瘤体组织治疗后HSP90及EGFR表达改变。
研究结果:1.免疫荧光染色和western blot结果显示三种非小细胞肺癌H460、A549、SPC-A-1细胞均存在HSP90阳性表达,正常人内皮细胞EC-304亦存在少量表达;17-AAG作用72h后对各肺癌细胞H460、A549、SPC-A-1半数抑制浓度依序为28.01nM、23.14 nM和26.54nM,均远低于EC-304=的半数抑制浓度769.8nM。2.放射性标记探针131I-17-AAG放射化学纯度>96.51%,4℃放置,体外保持较好的稳定性。标记探针与H460细胞上HSP90受体靶向结合特异性相对最高,为Kd=1.272nmol/L,而A549细胞膜上HSP90所需最大结合容量最多,为Bmax=0.086pmol/105个细胞,正常人内皮细胞结合饱和曲线呈非特异性结合。131I-17-AAG组对肿瘤细胞杀伤作用较17-AAG组明显(72h tH460=9.89,tA549=12.58和tSPC-A-1=10.84,均P<0.05)。17-AAG+131I-17-AAG联合治疗抑制效应显著,17-AAG具有一定的放射增敏效应。3.体内显像提示间质注射131I-17-AAG瘤体内放射性浓聚明显并长时间滞留,体内分布实验结果亦予证实;尾静脉给药瘤体内存在一定放射性摄取,药物体内清除较快;Na131I注射后迅速排出体外,无瘤内滞留;竞争性显像示瘤内摄取降低,标记探针与瘤组织为特异性结合。形态学观察显示131I-17-AAG的治疗抑瘤效应最好,瘤组织破坏最明显,优于静脉给药组。免疫组化显示间质及尾静脉注药组HSP90、Ki-67、Bcl-2阳性率均较对照组下降(统计值依次为HSP90 t间质=19.09和t静脉=6.10;Ki-67 t间质=11.54和t静脉=7.19;Bcl-2 t间质=11.27和t静脉=6.33,均P<0.05);Western blot结果显示随抑瘤作用增加,HSP90和EGFR蛋白表达降低。
研究结论:1.肺癌细胞对HSP90抑制剂17-AAG敏感性明显高于正常细胞,HSP90可以作为非小细胞肺癌治疗研究的有效靶点。2.放射性标记探针131I-17-AAG具有良好的体外生物学活性,131I-17-AAG对肺癌治疗较单纯17-AAG有明显增强作用,17-AAG亦具有一定的放射增敏效应。3.131I-17-AAG可以抑制表皮生长因子受体(EGFR)表达,可以增加EGFR耐受的肿瘤对相关化疗药物的敏感性。4.131I-17-AAG体内特异性靶向瘤体组织,能有效抑制裸鼠非小细胞肺癌的生长,以间质注药及间隔给药抑癌效应最佳,核素标记HSP90抑制剂对非小细胞肺癌治疗有较好应用前景。