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ZFN技术作为一种基因组修饰工具,具有高效、特异及适用性广泛的特点,近年来发展迅速,已成功应用于多种有机体及细胞类型的基因敲除。ZFN由一个非特异的Fok Ⅰ核酸内切酶DNA切割结构域和一个特异性的DNA结合结构域构成。ZFN进入细胞后可在基因组定点产生双链断裂,通过细胞对基因组DNA的自我修复途径可使基因打靶效率提高几个数量级。本研究拟采用这一技术探索猪繁殖与呼吸综合征病毒受体的敲除。PRRSV有三个相应受体,分别是唾液酸黏附素(Sialoadhesin, Sn)、硫酸乙酰肝素、CD163分子,其中Sn起关键作用,既能介导病毒吸附又能介导内吞,因此我们选择Sn基因作为敲除的靶基因,以提高猪对PRRSV的抗性。本实验拟探索通过ZFN技术敲除猪胎儿成纤维细胞系的Sn基因,并通过体细胞核移植技术,构建Sn基因敲除重构胚的技术体系,为实现猪基因的高效定点敲除奠定基础。主要包括以下三个内容：第一、猪胎儿成纤维细胞的分离培养和电穿孔转染研究首先成功分离并获得了猪胎儿成纤维细胞,并利用该细胞探索高效电转染方案。以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,采用L9(34)正交设计,对质粒浓度,电压和脉冲时间三个因素进行优化,并比较了不同温度处理对转染效率的影响以及电压对细胞存活率的影响。结果表明,在设定的范围内,三个因素中质粒浓度影响最大,质粒浓度和电压对转染效率均有显著影响,脉冲时间对转染效率影响差异不显著。不同温度处理对转染效率影响差异不显著,电压显著影响细胞存活率。细胞在常温条件下,采用40μg/ml质粒浓度,280V电压和800μS脉冲时间可以获得最高89.8%的转染效率。第二、猪卵母细胞体外发育及核移植系统的优化从猪卵母细胞体外成熟及胚胎体外激活着手,通过优化成熟培养液中激素添加方式和胚胎激活方案,建立了较完善的猪卵母细胞体外成熟及孤雌发育系统,在此系统下,屠宰场卵巢分离培养的卵母细胞体外成熟率达到80%,卵裂率达到90%,孤雌囊胚率达到50%。将此优化后的成熟和激活系统应用于转基因体细胞核移植胚胎的体外发育,获得了18%的囊胚发育率。第三、ZFN技术生产猪Sn基因敲除胚胎的初步探索试验将ZFN质粒电穿孔法高效转染猪胎儿成纤维细胞,建立单个成纤维细胞培养成株的方法,提取细胞DNA进行Sn基因敲除的鉴定。利用筛选后的转基因胎儿成纤维细胞进行核移植,体外发育至囊胚。建立了单个囊胚基因敲除快速检测的PCR方法,鉴定胚胎的基因敲除情况。本研究利用此技术体系,共验证了十个ZFN质粒的敲除效果,结果证实未发生敲除。