法氏囊(Bursa of Fabricius)是目前世界上唯一公认的体液中枢免疫器官。B-淋巴细胞这一术语来源于"bursa-derived lymphocyte"。Science文章证实囊素三肽(Lys-His-Gly)是第一个法氏囊来源的促进体液免疫反应的活性分子。临床应用研究发现,法氏囊组织灭活疫苗无论对法氏囊病毒超强毒还是变异株的免疫保护效果都是最好的,远超过其它法氏囊细胞苗、鸡胚苗。猪瘟脾淋苗的保护效果远远高于猪瘟细胞苗,脾脏转移因子有明显的免疫增强效果,市场很火,这些说明禽类和哺乳动物的免疫器官中存在共同的促进免疫反应的活性分子。目前,临床上主要依靠疫苗进行疫病预防。研究体液免疫系统中、促进疫苗整体免疫效果的活性分子对当前临床疫病防治具有重要意义。在哺乳动物中,B细胞分化器官一直悬而未决,骨髓仅被认为是类囊器官。目前对哺乳动物、人类和鸟类共有的T细胞分化发育器官胸腺及其活性成分的研究非常深入；而与胸腺相对应的、B细胞发育器官法氏囊的研究报道则比较少。法氏囊是体液中枢免疫器官发现于1956年,但至今,除了囊素,其他法氏囊活性分子及其作用机制鲜有报道。新型法氏囊活性肽的研究是体液中枢免疫系统研究的重要环节,对研究人类和哺乳动物的中枢体液免疫器官具有重要的指导意义。本研究攻克了法氏囊组分复杂、难以纯化的技术难题,新分离到9种多肽分子,并对这些分子进行了系统的研究,包括体液免疫、细胞免疫、作用受体、免疫调节作用机制、B细胞分化调控机制、物质代谢、信号转导及抗肿瘤等多方面的研究,取得了突破性进展。本研究主要内容包括：1新的法氏囊多肽分离及免疫调节活性初步鉴定本研究采用超滤浓缩、反向高效液相和质谱相结合的方法,从500g法氏囊组织中成功分离到9种新的法氏囊多肽(表1)。法氏囊多肽分别以50μg/mL剂量与禽流感病毒(AⅣ, H9N2)灭活疫苗混匀,腹腔注射免疫小鼠两次,初步验证了新分离法氏囊多肽具有免疫调节和促生长作用(表1)。据此,本研究筛选了BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ,对其在鸡体内和哺乳动物体内的免疫调节功能进行详细研究。2法氏囊活性肽在鸡体内的免疫调节作用研究为了探讨法氏囊新活性肽的免疫调节作用,在鸡模型中分别评价BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、 BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ对AIV疫苗或AIV抗原的免疫效果影响。通过检测HI抗体、细胞因子IL-4和IFN-γ水平发现,BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ均明显促进抗体水平升高,但是其对细胞因子反应的调节略有差异。BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ和BPP-Ⅰ同时促进Th1型(干扰素-γ)和Th2型(IL-4)细胞因子产生,说明这三种法氏囊活性肽能够诱导Thl和Th2型免疫反应。而BPP-Ⅱ主要促进鸡Th2型(IL-4)细胞因子产生,暗示在鸡免疫模型中,BPP-Ⅱ主要诱导Th2型反应。不过,其活性与剂量之间的关系还有待于进一步研究。3法氏囊活性肽在小鼠体内中的免疫调节作用研究为了探讨法氏囊活性肽在哺乳动物体内的免疫调节活性,本研究以小鼠为试验动物,用不同剂量的合成的法氏囊多肽BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ分别与AIV灭活疫苗或抗原充分混匀后,以腹腔注射的接种方式免疫BALB/c小鼠2次。结果发现,这四种法氏囊活性肽均具有免疫调节活性,包括促进抗体产生、提高细胞因子水平、促进T细胞亚型表达及脾脏淋巴细胞活力增加等方面,其不同之处表现在：(1)第一次免疫时,BSP-Ⅰ联合免疫组IgG抗体水平明显升高,不过重复免疫时抗体水平反而下降；(2)BSP-Ⅱ联合免疫组IgG抗体升高,且第二次免疫时抗体水平高于第一次免疫。不过,随着BSP-Ⅱ剂量增加,细胞因子(IL-4和IFN-γ)水平反而下降；(3)在AIV疫苗和AIV抗原两种免疫模型中,BPP-Ⅰ对IgG抗体和细胞因子(IL-4和IFN-γ)产生、T细胞亚型表达及淋巴细胞活力的调节活性相同；(4)在AIV疫苗和AIV抗原两种免疫模型中,BPP-Ⅱ对IgG抗体和细胞因子(IL-4和IFN-γ)产生、T细胞亚型表达及淋巴细胞活力的调节活性不同。这些数据表明法氏囊活性肽的免疫调节活性没有种属特异性,可以作为新的强效免疫调节剂或免疫增强剂应用于哺乳动物的疾病防控,不过,其免疫调节活性与其剂量、免疫类型等有关。4采用噬菌体文库筛选法氏囊活性肽在B淋巴细胞中的作用受体法氏囊是B细胞分化、成熟的关键器官。为了研究法氏囊新活性肽在B细胞中作用蛋白,分别以活性肽BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ为靶蛋白,采用鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体展示文库进行筛选。三轮筛选后,PCR扩增富集噬菌体克隆的插入片段。BP5是本实验室近期报道的一种法氏囊活性分子。鉴于其抗氧化和免疫调节功能,我们也对其作用受体进行了研究。PCR产物序列同源分析,初步确定了分别与BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ、BPP-Ⅱ和BP5作用的受体蛋白(表2),为深入研究法氏囊活性肽的生物学功能提供了新的方向。5采用鼠源基因芯片技术研究法氏囊活性肽对杂交瘤细胞的免疫调节作用机制为了研究法氏囊活性肽在体外对抗体产生的影响,采用BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ、 BPP-Ⅱ和BP5分别刺激杂交瘤细胞。结果显示,这些法氏囊活性肽以不同的剂量依赖性方式调节杂交瘤细胞分泌抗体。为了进一步研究法氏囊活性肽调节免疫的作用机制,本研究以杂交瘤细胞为免疫细胞模型,采用基因芯片技术分别检测5μg/mL BSP-Ⅱ、0.2μg/mL BPP-Ⅱ和2μg/mL BP5刺激杂交瘤细胞的基因表达情况,并进行了通路分析,如表3所示。GO分类分析发现,法氏囊活性肽BSP-Ⅱ、BPP-Ⅱ和BP5调控的基因分别参与多种免疫反应相关的生物学过程,如T细胞活化和增殖、B细胞活化及其介导的免疫、细胞因子产生等。这些结果提供了法氏囊活性肽调控免疫反应的分子基础,为研究中枢体液免疫器官调控机体免疫反应的作用机制和临床实践应用提供了重要的理论依据。6采用禽源基因芯片技术研究法氏囊活性肽对未熟成B细胞的作用机制法氏囊在B细胞的发展分化过程中发挥极其重要的作用。但法氏囊活性肽调节B细胞发育的作用机制尚不清楚。为了研究法氏囊活性肽对未成熟B细胞活性的作用,本研究以禽pre-B细胞系DT40细胞为模型,首先检测了各种法氏囊活性肽对禽DT40细胞活力的影响。结果显示,BP5和BSP-Ⅰ以剂量依赖性方式抑制DT40细胞增殖,BSP-Ⅱ则明显促进DT40细胞增殖,低剂量的BPP-Ⅱ促进DT40细胞活性增加,而BPP-Ⅰ对DT40细胞活性影响不大。为了深入了解法氏囊活性肽对未成熟B细胞分化调节的作用机制,本研究采用基因芯片技术,检测了BP5、BSP-Ⅱ和BPP-Ⅱ刺激后DT40细胞中分子水平变化情况。通路分析发现,BP5、BSP-Ⅱ和BPP-Ⅱ分别调控多种细胞内通路过程(表4)。这些结果揭示了法氏囊活性肽调控未成熟B细胞的作用机制。这些数据为深入研究中枢免疫器官调控机体B细胞分化和体液免疫反应提供了重要的实验依据。7法氏囊活性肽抗肿瘤作用机制研究为了探索法氏囊活性肽是否具有抗肿瘤功能,本研究以肿瘤细胞系Hela和MCF-7为肿瘤细胞模型,采用MTT方法检测细胞活力。结果显示,法氏囊活性肽以不同程度调控肿瘤细胞的增殖活力。BP5和BSP-Ⅰ明显抑制肿瘤细胞生长,而BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ对肿瘤细胞增殖的有正负双重作用,即低浓度时,促进肿瘤细胞增殖,而高浓度时,则抑制肿瘤细胞增殖。本研究中没有发现五种法氏囊活性肽对普通细胞增殖具有抑制作用。为了进一步研究法氏囊活性肽抗肿瘤的作用机制,本研究以抑癌分子p53为模型展开试验。Luciferase活性和West-blotting结果显示,BP5、BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ分别以不同的剂量方式增强p53活性,促进p53蛋白表达和p53蛋白稳定。此外,本研究还发现,各种法氏囊活性肽能促进促细胞凋亡分子Bax蛋白的表达。结果表明,法氏囊来源的免疫活性分子具有抗肿瘤功能,为中枢体液免疫系统拮抗机体肿瘤发生的作用机制提供了重要的依据。综上所述,法氏囊多肽不仅对研究中枢体液免疫系统具有极其重要的指导作用,而且对研究机体正常生理过程和各种重大疾病如遗传病、肿瘤、代谢性疾病等的发病机制的分子基础具有重要意义,同时对临床应用研究具有重要的实践指导意义。