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[背景]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染人体诱导急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎及肝硬化、肝纤维化和肝细胞癌,仍然是世界上最严重的公共健康问题之一。我国每年新发乙肝感染者仍有百万之巨,而现有乙肝治疗药物如核苷酸类似物、干扰素等,不能完全清除病毒,寻找新的乙肝病毒抑制剂或相关分子靶点显得十分迫切。三重基序蛋白(Tripartite motif protein,TRIM)家族成员TRIM21具有E3泛素连接酶活性,参与多种细胞生理功能,在病毒感染过程中发挥正向调控干扰素通路抗病毒和负向调控干扰素通路促进病毒复制的双重功能。有报道显示TRIM21通过其胞浆IgFc受体功能间接抑制HBV复制,但仍不清楚TRIM21是否具有直接抑制HBV复制的功能。[目的]探究TRIM21在肝细胞内HBV复制过程中发挥的作用及其分子机制。[方法]1.HBV感染肝细胞模型:以1μg pUC19-HBV1.3质粒转染肝癌细胞系Huh7和HepG2,48 h后逆转录定量PCR检测HBV复制中间体HBV RNA、ELISA检测上清包膜蛋白s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)证实感染。2.建立体内瞬时HBV感染小鼠模型:通过高压尾静脉快速注射10 μg的pUC19-HBV1.3质粒至小鼠,4天后肝细胞可测HBV RNA表达,血清可测HBeAg和HBsAg蛋白的分泌,肝脏可原位检测HBc抗原表达。3.敲低和过表达TRIM21:肝癌细胞转染p-Flag-TRIM21可上调TRIM21的表达,转染TRIM21特异性siRNA可敲低内源性TRIM21表达。4.TRIM21结构域缺失体质粒的构建:酶切连接法分别构建TRIM21的ΔRING、ΔB-BOX、ΔPRY/SPRY缺失突变体质粒。5.TRIM21的抗HBV复制活性检测:TRIM21的各种表达质粒与pUC19-HBV1.3共转HepG2细胞,48 h后逆转录定量PCR检测复制中间体HBV RNA;ELISA检测上清HBeAg和HBsAg水平;绝对定量PCR检测上清HBV DNA水平;巢式PCR检测细胞中HBV Precore-core DNA水平。6.免疫共沉淀筛选与TRIM21互作的HBV蛋白:将带Myc标签的HBV蛋白质粒p-HBx、p-HBs、p-HBc或空载质粒分别与p-Flag-TRIM21共转HEK293T细胞,48 h进行SDS-PAGE,以Flag抗体明确与TRIM21互作的HBV蛋白。7.泛素-蛋白酶体途径降解病毒蛋白实验:p-Flag-TRIM21与p-Myc-HBx共转HEK293T 细胞,48 h 后检测 HBx 表达。p-Flag-TRIM21 与 p-Myc-HBx 和 HA-总泛素化质粒共转HEK293T,48 h后,蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞4 h,以抗Myc-HBx抗体进行免疫共沉淀,Western blot检测泛素化修饰的改变。8.构建TRIM21瞬时过表达小鼠和TRIM21敲除小鼠:C57雌性小鼠通过高压尾静脉注射20μg/只p-Flag-mTRIM21,验证TRIM21在小鼠体内过表达。由南京生物医药研究院构建TRIM21杂合子敲除小鼠,杂交得到TRIM21纯合子敲除小鼠。9.乙肝小鼠体内检测TRIM21对HBV的直接抑制功能:将p-Flag-mTRIM21与pUC19-HBV1.3高压尾静脉注射C57小鼠,或pUC19-HBV1.3注射TRIM21-KO和WT小鼠,4天后检测血清HBeAg和HBsAg水平;qRT-PCR检测肝脏HBV RNA水平;免疫组化检测肝脏HBcAg和HBxAg的表达。[结果]1.HBV感染肝细胞显著上调TRIM21的表达:在HBV细胞模型中,证实HBV感染肝细胞诱导TRIM21在mRNA水平和蛋白水平的显著上调表达。2.TRIM21可显著抑制肝细胞内HBV的复制与表达:Huh7和HepG2中,过表达TRIM21均可显著抑制HBV RNA和HBeAg、HBsAg的表达。而以siRNA下调TRIM21则可显著增加HBV RNA和HBeAg、HBsAg水平。3.TRIM21的抗病毒效应依赖于RING结构域:TRIM21的RING和PRY-SPRY结构域缺失体阻断了 TRIM21的抗HBV作用。4.TRIM21与HBx之间相互作用:免疫共沉淀实验证实TRIM21可与HBx蛋白之间存在强相互作用,与HBc之间存在弱相互作用,而与HBs之间不存在相互作用。免疫荧光实验证实TRIM21与HBx确实存在相互作用。5.TRIM21通过泛素-蛋白酶体途径降解HBx蛋白:HEK293T细胞中,共转TRIM21可直接下调HBx蛋白水平,而对HBc表达无影响;MG132处理可逆转HBx表达。泛素实验证实TRIM21可促进HBx上发生的泛素化修饰。6.TRIM21在小鼠体内具有显著抑制HBV复制的功能:C57小鼠经高压尾静脉同时注射HBV和p-Flag-mTRIM21,4天后肝脏HBV RNA、血清HBeAg和HBsAg表达显著降低,免疫组化证实肝脏HBcAg、HBxAg表达显著降低。与WT小鼠相比,TRIM21 敲除小鼠的 HBV RNA、血清 HBeAg 和 HBsAg、肝脏 HBcAg、HBxAg水平均显著增高,证实TRIM21具有显著的体内抗HBV功能。[结论]以HBV感染人肝细胞和小鼠瞬时乙肝感染为模型,本研究阐明了 E3泛素连接酶TRIM21抑制HBV复制的作用和创新机制:HBV感染可显著上调肝细胞内TRIM21表达;TRIM21在体内外均显著抑制HBV复制,该功能依赖于RING结构域和PRY-SPRY结构域;TRIM21可与HBx直接相互作用,经泛素-蛋白酶体降解HBx以抑制HBV复制。本研究首次揭示了 TRIM21对HBV的直接抗病毒作用,并创新性发现TRIM21作用的HBV靶蛋白,补充了 TRIM21抗HBV复制的新机制,提供了乙肝治疗的候选新靶点和新策略。