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非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的发病率和死亡率居高不下,其中肿瘤细胞化疗耐药是导致治疗失败的主要原因之一。近年来,随着肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)研究的进展,越来越多的证据表明,肿瘤干细胞是恶性肿瘤发生、进展和复发的“根源”,其对化疗高耐药特性可能是导致肿瘤化疗失败的原因。肿瘤干细胞是肿瘤组织中存在着极少一部分具有自我更新、多向分化潜能和高致瘤性等干细胞样特性的细胞。至今,已在恶性胶质瘤、乳腺癌、白血病和肺癌等恶性肿瘤中分离出CSCs。研究已发现,众多肿瘤干细胞具有较分化后肿瘤细胞更高的天然耐药能力。如在胶质瘤干细胞中,高表达多药耐药相关蛋白1 (multi-drug resistance-associated protein、乳腺癌干细胞高表达腺苷三磷酸结合盒转运体G2(ABCG2)等。但迄今为止,人肺癌干细胞研究尚处于初级阶段,其耐药特性有待于全面、深入的研究。因此,本研究采用无血清培养法从肺腺癌A549细胞株中分离、鉴定肺癌干细胞后,探讨其有关的耐药生物学特性和机制,以期为肺癌干细胞的靶向治疗提供实验基础。研究目的1.无血清悬浮培养获得肺癌A549细胞球；检测其干细胞标志物的表达；2.探讨细胞球耐药生物学特性。材料和方法实验材料：肺腺癌A549细胞株由第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所提供；NOD /SCID免疫缺陷小鼠由第三军医大学新桥医院动物室提供[动物生产许可证号为SCXK(京2009-004),合格证号为(0162081)],3～4周龄,此项实验均在第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所进行。实验方法：1.细胞培养：A549细胞：含10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃、饱和湿度下5%CO2的培养箱中进行传代培养；A549细胞球：DMEM/F12培养基(胰岛素4U/L+B27 1x+EGF20μg/L+ bFGF 20μg/L),37℃、饱和湿度下5%C02的培养箱中进行传代培养；2.流式细胞技术检测干细胞标志物CD133的表达；3.免疫荧光激光共聚焦显微镜检测其干细胞标志物CD133和CD44s的表达情况；4.MTT法检测细胞增殖、半数抑制浓度(IC50)；5.流式细胞技术及免疫荧光检测细胞凋亡、细胞周期；6. Western blot及免疫荧光检测GST-π蛋白的表达;7. RT-PCR检测MRP1、LRP基因的表达；8. NOD/SCID小鼠致瘤实验。结果1.无血清悬浮培养法能够培养出A549细胞球,倒置相差显微镜下观察：大小不一的球状细胞团,悬浮于培养基中,细胞球由10至20个细胞组成,结构较致密而不易吹散,相差显微镜下透亮,折光性较强。2.流式检测A549细胞球和A549细胞系CD133的表达有差异。A549细胞球CD133的表达为(66±1.23)%,A549细胞系CD133的表达为(10.2±0.83)%,n=3,P<0.05。3.免疫荧光激光共聚焦显微镜检测显示A549细胞球表达CD133、CD44s干细胞标志物。4.MTT法检测显示：A549细胞球倍增时间为53.96 h,A549细胞系倍增时间为75.6 h,A549细胞球对顺铂(Cisplatin,DDP)和吉西他滨(Gemcitabine, GEM)的耐药性较其细胞系强,Cisplatin对A549细胞球和A549细胞系的IC50分别为18.25±0.66 mg/L和3.8±0.36 mg/L, Gemcitabine对A549细胞球和A549细胞系的IC50分别为280.38±8.2 mg/L和189.47±5.65 mg/L,P<0.05。5.流式细胞技术检测细胞周期、细胞凋亡结果显示；A549细胞球和A549细胞系的周期分布(Go/G1和S期)无明显差异；A549细胞球和A549细胞系处于G2/M期的细胞为(17.2±0.54)%Vs(4.75±0.35)%,P<0.05；两组细胞经Cisplatin和Gemcitabine诱导凋亡24h后,A549细胞系处于S期的细胞与对照组相比有统计学意义,P<0.05；而A549细胞球处于Go/G)和S期的比例与对照组相比无明显差异；两组细胞经Cisplatin和Gemcitabine诱导凋亡24h后,经流式细胞技术分析细胞凋亡率分别为：A549细胞球/DDP：14.64±1.23%,A549细胞系/DDP:72.16±5.63%,A549细胞球/GEM:34.38±2.94%,A549细胞系/GEM:77.32±4.73%,A549细胞球/control:4.16±1.12%,A549细胞系/control:11.83±1.56%,P<0.05。6. RT-PCR、Western blot方法检测到A549细胞球MRP1、LRP基因及GST-π蛋白的表达量较A549细胞系显著增高(P<0.05)；激光共聚焦荧光显微镜检测显示：GST-π蛋白主要表达在胞质,A549细胞球中GST-π蛋白表达比A549细胞系增高,(P<0.05)。7. NOD/SCID裸鼠(第三军医大学新桥医院动物室提供)皮下成瘤后,于第45天取出皮下肿瘤进行病理检查。采用荧光免疫组化法检测GST-π在成瘤组织中的表达,结果显示：GST-π抗体阳性表达位于胞质,呈红色荧光；A549细胞球成瘤组织和A549细胞系成瘤组织中红色荧光的平均荧光强度分别为：18.53±0.77、12.54±0.49,两者比较具有统计学差异,P<0.05。结论1.无血清悬浮培养法成功培养出A549细胞球,高表达干细胞标志物CD133和CD44s；2.A549细胞球比A549细胞系具有更强的耐药特性。