论文部分内容阅读
阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种常见的神经退行性疾病,其典型的特点是淀粉样前体蛋白产生的β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Ap)沉积并形成老年斑(senile plaque, SP)。因此,SP是AD病理损伤的标志之一。但目前还没有有效的治愈AD的于段,药物仅可以在一定程度上延缓疾病进程。因此,早期诊断显得尤为重要,以便早发现早进行干预治疗。目前,SP的检测方法主要有免疫组化、银染、刚果红染色及硫磺素染色(Thioflavine S, Th-S)等,其中刚果红和Th-S染色是两个主要的组织学染色方法,他们通过与SP构象的特征性β折叠相结合,检测任何形式的SP,使其呈阳性染色。但是,以上每种方法都有它们的缺点,如低灵敏度、低特异性或病繁琐的理染色过程,而且染料、染色方式、标本质量及人为因素等影响结果的准确性。因此,现有的病理检查技术很难满足临床上对AD病理损伤诊断的准确性、特异性和敏感性的要求。所以迫切需要找到一种灵敏、稳定、简单易行的检测SP的方法。实际上,可能有一种简单、灵敏的检测SP的方法一一用紫外光激发SP后观察蓝色的自发荧光信号。从1970年Schwartz声明SP能发出自发荧光(没提供详细材料)到现在,已经有几篇国外研究者的文章被发表。然而,利用Auto-F观察SP的方法没有被应用于AD检测或诊断。其原因可能是很少有人知道且没有被重视,另一个是自发荧光的来源和特性尚不清楚。本文以APP/PS1转基因AD模型小鼠为研究对象,进一步研究了自发荧光的来源和特性并与常规染老年斑的方法进行了比较验证。脑组织冰冻切片经清洗、贴片后,用奥林巴斯荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察自发荧光,后者成像更清晰,且图像的分辨率高。拍完自发荧光后,再分别进行常规的银染、刚果红、Th-S染色及免疫组化染色,最后对同一张脑片染色前后的成像结果进行比较验证。同时,我们做了SP的特征谱线,以便于了解其光学特性,为应用于临床诊断提供实验依据。结果如下:1.在无染色无标记情况下,紫外光和可见光均可诱发SP发出自发荧光,尤其是在波长较短的405 nm蓝紫光下,可以观察到高度聚集的斑块及松散的纤维状的Aβ结构。2.405nm激光下的蓝色荧光信号是来自SP的某种成分,其可被刚果红和Th-S阳性染色,表明此成分含Aβ,且经验证表明其自发荧光的结构基础可能是β折叠结构。与DNA无关。3.SP的最佳激发波长<350rnm,在近紫外的405nm的蓝紫光下仍有很强、特异的信号,能明显地与背景荧光区分开来,信噪比好。与350nm的紫外光相比,405nm的蓝紫光成像深度更大,而对组织的损伤更小。4.SP在405nm激光下的发射谱峰主要在420-550nm波段,具有特异性的双发射峰位(440nm和465nm),可与DAPI-DNA复合物(460nm)的荧光信号明确区分。5.与传统的病理检测方法如银染、刚果红染色及Th-S染色相比,自发荧光有绝对的优势——无需对标本进行任何染色,便可获得清晰、特异、直观的图像,而且操作简单,成本低。6.我们可以通过自发荧光检测胞外的Ap沉积,替代昂贵的Ap抗体检测。以上结果表明,自发荧光检测SP的方法具有简单、快速、灵敏、特异的特点,可以替代其它常规染色方法应用于基础研究及临床病理检测。此外,SP自发荧光具有特征性的发射光谱,这些结果为SP自发荧光检测方法的应用提供了实验证据。