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近年来,水稻条纹叶枯病在我国广大稻区暴发流行,对水稻生产构成极大威胁。该病是由灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)传播水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的,病毒能在灰飞虱体内循回并增殖,并由灰飞虱以持久方式经卵传播。水稻条纹叶枯病的流行和暴发与灰飞虱的广泛发生有着非常密切的关系。因此,了解灰飞虱对RSV的专化性识别和传播机制是防治该病害的关键。目前,灰飞虱传播RSV机制的研究主要集中在传统生物学水平,其分子机制还不清楚,有待更深层次的研究。为了阐明灰飞虱传播RSV的机制,本论文从灰飞虱体内RSV特异性互作因子等角度展开了研究。水稻条纹病毒7个基因在水稻和灰飞虱体内表达量分析：利用Real time Q-PCR分析比较了RSV全部7个基因在感病水稻和带毒灰飞虱体内的表达丰度。结果显示,沉默抑制子NS3基因在水稻和灰飞虱体内均为最高表达水平,NS3基因的高丰度表达说明RSV侵入寄主细胞后,必须首先抑制寄主的免疫系统,以保证自身的复制,但同样作为沉默抑制子的NS2基因在两类寄主内的表达量都不高,NS3和NS2如何协调沉默抑制功能值得进一步研究。病害特异性蛋白SP基因仅在水稻中高丰度表达,在灰飞虱体内表达量相对偏低。与复制酶(?)RdRP基因在灰飞虱体内的极低表达量(NCP基因的0.2倍)相比,RdRP基因在水稻中的表达量相对较高(NCP基因的0.8倍),这暗示RSV在水稻中的复制可能要比在灰飞虱体内更加强烈。5个灰飞虱蛋白涉及水稻条纹病毒与介体的互作：以实验室多代筛选获得的高亲和性无毒灰飞虱群体为材料,采用双向电泳(2-DE)分离灰飞虱总蛋白,通过病毒覆盖测定(virus overlay assay)从灰飞虱总蛋白中筛选出5个能与RSV病毒粒子特异性结合的蛋白因子。对互作因子进行钠升高效液相色谱-电喷雾碰撞诱导解离串联质谱法(Nano LC-ESI-CID-MS/MS)测定,5个蛋白分别鉴定为有活性的蛋白激酶C受体(the receptor for activated protein kinase C, RACK)、60S核糖体蛋白L5(60S ribosomal protein L5, RPL5)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH3).60S RPL7a和60S RPL8。以质谱鉴定获得的蛋白肽序列标签检索灰飞虱转录组数据库,得到蛋白的部分序列信息,进一步克隆了5个互作蛋白因子的全长基因。对5个蛋白因子进行互作功能验证,酵母双杂交实验显示,RACK和GAPDH3与RSV-NCP无互作关系,RpL5、RpL7a和RpL8与RSV-NCP存在较强的互作关系；将5个互作蛋白进行了蛋白表达,并通过表达蛋白的体外病毒结合实验(far-Western blot和DIBA)分析5个互作蛋白的病毒结合能力,far-Western blot(?)勺结果与酵母双杂交一致,斑点免疫检测(DIBA)显示5个蛋白对RSV粒子均有结合能力。结论：RACK和GAPDH3(已证实为蚜虫的传毒biomarker)与病毒的互作可能依赖于蛋白在膜系统中的特殊构象,推测参与病毒的跨细胞作用；3个核糖体蛋白(RpL5、RpL7a和RpL8)可能参与RSV在灰飞虱体内的增殖。灰飞虱高带毒(RSV)群体酵母双杂交cDNA文库的构建及NCP互作因子的筛选：以实验室筛选的灰飞虱高亲和性高带毒群体(简称高带毒群体)为材料,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,连接三框型接头并纯化。采用同源重组反应制备三框型cDNA入门文库,再通过gateway策略将入门文库转移到兼容载体pGADT7-DEST,构建获得酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明：文库库容量为3.68×107cfu,扩增文库滴度为2.62×1010cfu/mL;文库重组率大于95%,cDNA插入片段平均长度>1kb,达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。建库完成后,以RSV-NCP蛋白为诱饵,利用酵母双杂交系统筛选cDNA文库,从中钓取能够与NCP蛋白互作的灰飞虱蛋白。经测序分析,共获得13个RSV互作蛋白,结合已有的文献报道,对这些蛋白在病毒与介体互作过程中的作用进行了初步推测。灰飞虱内生病毒HiPV与RSV传播相关性初探：以寄(共)生微生物为突破口,研究内生病毒HiPV (Himetobi P virus)对灰飞虱传播RSV的影响。利用大肠杆菌系统和pET系列载体表达了HiPV外壳蛋白VP1,经Ni-NTA树脂亲和层析柱纯化了VP1蛋白,并免疫家兔制备了抗体。Western-blot结果显示,能够从灰飞虱体内特异地检测出HiPVo基于RT-PCR和Western-blot方法,建立了单头灰飞虱HiPV检测体系,并检测不同类型的灰飞虱群体中HiPV的感染情况,对内生病毒HiPV与RSV传播之间的相关性进行了初步分析。结果显示,HiPV在灰飞虱高亲和性群体内广泛存在,灰飞虱携带RSV与体内感染HiPV存在一定的对应关系。酵母双杂交分析显示RSV-NCP与HiPV外壳蛋白VP1存在较强互作关系。根据当前的研究结果,提出了一个研究假说,即灰飞虱高亲和性群体对RSV具有高亲和性的主要原因,是灰飞虱体内感染了昆虫病毒HiPV。这将有助于从灰飞虱体内寄(共)生微生物角度研究灰飞虱传毒机制。RSV编码的NSvc2蛋白的结构预测和验证：RSV与番茄斑萎病毒(TSWV)在进化上存在着较近的亲缘关系,并且RSV与TSWV在基因组结构和功能方面存在对应性。RSV编码的NSvc2蛋白与TSWV的膜糖蛋白(参与蓟马传播的决定因子)相对应,因此推测NSvc2蛋白为RSV参与灰飞虱传播的决定因子。对NScv2蛋白进行了结构预测分析,并绘制|NSvc2蛋白拓扑结构示意图,预测NSvc2为糖蛋白,在寄主体内存在切割现象,被切割成2个蛋白R-GN/R-Gc行使功能。经Western-blot分析验证,NSvc2在水稻中被切割成2个蛋白,与预测结果基本一致；在灰飞虱体内,NScv2为完整的94kDa蛋白,无切割现象。这是首次发现RSV NSvc2蛋白在水稻和灰飞虱体内以2种不同的形式存在,与RSV其它基因产物不同。研究结果为鉴定NSvc2蛋白为RSV传播决定因子奠定了基础。本论文的研究为深入了解灰飞虱的传毒机制以及开展水稻条纹叶枯病的防治提供了新的理论基础和新思路。