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β-聚-L-苹果酸(PMLA)是一种具有极佳水溶性的阴离子聚酯,在医学及其它工业中受到越来越多的重视。本文系统地研究了菌株出芽短梗霉ipe-1生产PMLA的发酵条件及培养基组成、PMLA的代谢途径、细胞生长与PMLA合成的关系、在对数生长后期提高PMLA产量的策略和PMLA的结构特性。
pH6.0和溶解氧浓度(D0)大于70%时PMLA产量最高,同时pH对细胞的形态有明显的影响,当pH大于等于6.0时,细胞主要呈酵母形态,此形态细胞是主要的PMLA生产者。高DO、高转速将促进细胞生长,但却降低了PMLA对葡萄糖的得率,而在对数生长前期高细胞浓度有利于PMLA的合成,因此采用三段DO和搅拌控制策略有利于促进PMLA合成且提高PMLA对葡萄糖的得率,第一阶段恒定高转速(800rpm)维持DO大于70%;第二阶段当DO自然降至70%时,通过搅拌与DO偶联控制DO70%促进PMLA的合成;第三阶段低转速(400rpm)高DO(70%)降低细胞生长速率,进而提高PMLA对细胞的得率。
PMLA的合成与葡萄糖的消耗速率及细胞的生长速率成正比。采用氧化态氮源硝酸钠时PMLA产量最高,而随着还原态铵浓度的增加PMLA产量降低;当硝酸钠浓度大于6g/L时,将显著降低黑色素的合成,最大PMLA产量达到37g/L。初始5g/L酵母粉和190g/L葡萄糖对PMLA的合成较适宜,进一步增加酵母粉浓度对细胞生长无明显促进作用,葡萄糖浓度大于190g/L将抑制细胞的生长。当在培养基中添加锌离子利磷酸二氢离子时将提高PMLA的生产强度,尽管锰离子对PMLA的生产强度也有促进作用,但是同时促进了黑色素的合成,铁、镁、铜及钾离子对PMLA的产生无明显促进作用,而添加0.1g/L氯化钙却使PMLA产量提高11.38%。氢氧化钠和碳酸钠做中和剂对PMLA合成无明显影响,而采用氨水做中和剂导致生物量增加23.41%,PMLA产量降低19.96%。
PMLA的合成与细胞的生长在对数生长前期相偶联,而在对数生长后期出现部分解离,原因是高浓度的PMLA(大于40g/L)不仅抑制PMLA的合成而且对细胞的生长有害,另外,存对数牛长后期培养基中氧化还原电位(CRP)从57mv升高到100mV,缺乏还原力也将降低PMLA的生产强度。因此,通过半连续发酵维持细胞处于对数生长阶段或通过膜一细胞循环移除新产生的PMLA将提高PMLA的生产强度,同时无论在哪种发酵模式下在对数生长后期控制CRP小于70mV都将促进PMLA的产生。在超过240h的5个半连续发酵周期内PMLA的平均浓度60.19g/L、生产强度达到1.15g/L·h。
当葡萄糖作为补料溶液的碳源,发酵结束时分批发酵与分批补料发酵中PMLA产量无明显差别。初糖为蔗糖时PMLA产量最高,而为果糖时PMLA对菌体的得率最高,自36h开始连续补充葡萄糖与蔗糖(10:1)混合液可维持CRP小于70mV,PMLA产量达到63.2g/L,同时发酵体积增加25%。另外,补充外源L-苹果酸、丁二酸、三氟乙酸和亲和素对PMLA的合成无明显影响,而生物素、丙酮酸及高的CRP将抑制PMLA的合成,这说明PMLA的合成途径主要涉及磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在PEP羧化酶催化下经由草酰乙酸合成PMLA的还原途径。
从菌株ipe-1发酵液提取获得的PMLA重均分子量为10.58Kda,分散系数1.13,而在发酵过程中PMLA重均分子量变化范围为12.7-18.6Kda,在190-260nm具有正向的CD谱带。