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研究背景与目的肝衰竭是多种因素引起的严重而广泛的肝细胞死亡,导致肝脏本身合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿,出现以凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床证候群。肝衰竭内科综合治疗效果不佳,预后差,病死率高,严重威胁患者的生命健康,影响社会稳定。肝衰竭的发病机制复杂,已成为肝病学的研究热点。在肝衰竭发生和发展过程中,天然免疫系统的单核/巨噬细胞起了重要作用。巨噬细胞在各免疫细胞中的比例、免疫功能状态以及释放炎症因子的类型决定着肝脏局部炎症状态,最终影响肝衰竭的临床特点和结局。若能深入研究肝衰竭进程中肝脏巨噬细胞的表型及功能改变,早期抑制巨噬细胞的过度活化,阻止炎症重症化,便有可能从源头上遏制肝衰竭的发生。目前有关肝衰竭时单核/巨噬细胞功能状态的演变规律以及调节机制仍不清楚,为此本课题旨在研究单核/巨噬细胞在肝衰竭进程中的动态表型及功能变化、探讨免疫分子高迁移率族蛋白1(high mobility group box protein1, HMGB1)对肝脏巨噬细胞的炎症免疫调控作用、揭示调节肝脏巨噬细胞功能的分子靶标及相关信号通路,为肝衰竭早期诊断、预防和治疗提供新的思路。研究方法1.体内实验经小鼠尾静脉注射Con A (20mg/kg)制备小鼠急性肝衰竭模型,并于注射后1、3、6、12、24小时处死动物,收集肝组织和外周血,对肝组织进行苏木素-伊红染色观察肝组织病理学改变,同时进行肝功能(丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶)检测。分离1、3、6小时组以及正常对照组的外周血单个核细胞和肝脏巨噬细胞,通过流式细胞术检测外周血Ly6C+CD11b+单核细胞和肝脏F4/80+巨噬细胞的表达频率,荧光定量PCR检测肝脏巨噬细胞中TNF-α、IL-6及HMGB1mRNA的表达水平,Annexin V和原位末端转移酶标记技术检测肝脏巨噬细胞的凋亡情况,Western blot试验和免疫荧光激光共聚焦技术检测肝组织及肝脏巨噬细胞中HMGB1的表达及转位,同时用ELISA方法检测血清HMGB1水平。2.体外实验原代分离、培养和鉴定正常小鼠来源的肝脏巨噬细胞,用HMGB1-siRNA干扰细胞中HMGB1的表达,给予Con A5μg/ml体外诱导培养24小时后,流式细胞仪检测MHC的表达,ELISA法检测细胞培养上清液TNF-α及IL-6水平,同时用Western blot检测MAPK通路相关蛋白(ERK和p38MAPK)的磷酸化水平。3.临床研究采自63例慢性轻/中度乙型肝炎、39例慢加急性肝衰竭(早期)、27例HBV携带者及18例健康对照者的血清,病例组和对照组在年龄、性别方面均无显著生差异(P>0.05),用ELISA方法检测HBV血清标记物和血清HMGB1水平,同时检测血清病毒学指标、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素和凝血酶原活动度,并分析血清HMGB1与各肝功能指标之间的相关性。研究结果1.体内实验结果(1)肝衰竭进程中,外周血炎症性Ly6C+CD11b+单核细胞亚群在总CDllb+单核细胞中的比例逐渐增高。(2)肝脏巨噬细胞表达TLR4和MHCⅡ的水平以及TNF-α和IL-6mRNA水平在肝衰竭早期明显增高,后期呈减少趋势。(3)肝衰竭进程中,肝脏巨噬细胞在肝脏单个核细胞中的比例逐渐减少,同时细胞的凋亡率增加。(4)血清及肝组织HMGB1的水平随着疾病进展而明显增加,呈现时间依赖效应。(5)肝脏巨噬细胞中HMGB1的表达在肝衰竭早期明显增高,部分HMGB1蛋白从胞核转移至胞浆,后期可释放至细胞外,而且表达呈减少趋势。2.体外实验结果(1)经HMGB1-siRNA干扰后,受Con A刺激的肝脏巨噬细胞中MHCⅡ的表达水平仍升高,与对照-siRNA组比较无明显差异(P>0.05)。(2)经HMGB1-siRNA干扰后,受Con A刺激的肝脏巨噬细胞释放TNF-a及IL-6减少,与对照-siRNA组比较有明显差异(P<0.05)。(3) Con A刺激后,肝脏巨噬细胞中ERK and p38MAPK蛋白的磷酸化水平升高,经HMGB1-siRNA干扰后,可以显著减轻以上两个信号蛋白的磷酸化水平,与对照-siRNA组比较有明显差异(P<0.05)。3.临床研究结果(1)轻/中度乙型肝炎和慢加急性肝衰竭(早期)患者血清中HMGB1的水平明显高于HBV携带者及健康对照者(P<0.05),轻/中度乙型肝炎组和慢加急性肝衰竭(早期)组之间也有明显差异(P<0.05)。(2)慢性乙型肝炎患者血清HMGB1水平与ALT/AST水平及血清总胆红素水平成正相关性(P<0.05),与凝血酶原活动度成负相关性(P<0.05)。研究结论(1)肝脏巨噬细胞在Con A诱导的小鼠急性肝衰竭的不同阶段表现出不同的功能状态：早期,肝脏巨噬细胞呈现促炎症活化状态,抗原递呈功能增强；随后巨噬细胞呈功能耗竭状态,并伴随细胞凋亡的发生。(2)细胞内高迁移率族蛋白1通过ERK and p38MAPK通路调节肝衰竭早期肝脏巨噬细胞的促炎症活性,促进肝衰竭时肝脏炎症损伤的病理过程。(3)对乙肝患者进行的分子流行病学调查显示,高迁移率族蛋白1对乙型肝炎的进程有重要的提示作用,对肝衰竭的诊断和治疗有重要的意义。