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肿瘤坏死因子(TNFα)是一种多效应的前炎症细胞因子,由巨噬细胞、单核细胞、多形核白细胞、肥大细胞及光滑肌细胞等多种细胞产生,在不影响正常细胞的前提下,于体内外均能杀伤肿瘤细胞并抑制肿瘤细胞的增殖;参与和调控机体的免疫应答,上调其他炎症细胞因子的表达,增强包括吞噬、化学趋化、反应性氮氧物质的产生等一系列细胞学反应。
本文利用同源克隆和RACE方法从健康斜带石斑鱼头肾组织中克隆得到了斜带石斑鱼TNFα全长cDNA序列和基因序列。斜带石斑鱼TNFα的cDNA序列全长为1377bp,含有一个762bp的开放阅读框,编码253个氨基酸的蛋白。经生物信息学分析,斜带石斑鱼TNFα是一种跨膜蛋白,具有潜在的蛋白酶切位点及对其三级结构形成必需的2个半胱氨酸,也具有TNF家族的标签序列及5个炎症细胞因子不稳定基序ATTTA;进化树构建结果表明:斜带石斑鱼TNFα与其他鱼类TNFα占据进化上独立的分枝,且与已报道的鲈形总目鱼类TNFα具有最近的亲缘关系:空间结构模拟显示:斜带石斑鱼TNFα与哺乳类TNFα的空间结构相似,内层与外层均由5个β折叠片结构构成。斜带石斑鱼TNFα基因长度为1801bp,由四个外显子和三个内含子组成,与其他鱼类具有相似的结构特征。
利用RealtimePCR技术,分析了TNFα在健康斜带石斑鱼各组织中的表达情况以及分裂素LPS、PolyI:C对斜带石斑鱼头肾淋巴细胞TNFα基因表达的影响。定量结果显示,TNFα在健康斜带石斑鱼各组织中呈组成型表达,在头肾、脾、肾脏、鳃与下丘脑等组织中均有较高表达,在肠道与肌肉组织中的表达量最低;研究还发现TNFα在垂体与下丘脑中以较高水平表达,尤以下丘脑最高,提示TNFα在神经内分泌系统中起着重要作用。分裂素LPS与PolyI:C刺激斜带石斑鱼头肾淋巴细胞均能显著诱导TNFα基因的表达,但二者的作用效果并不相同。经LPS刺激后的淋巴细胞TNFα基因表达量在16h达到了最大,而PolyI:C刺激后的淋巴细胞TNFα基因表达量在检测的24h内一直在增大。
为了进一步研究斜带石斑鱼肿瘤坏死因子α的生物学功能,我们利用pET32a(+)质粒构建了表达TNFα成熟肽的重组质粒,并将该重组质粒转入大肠杆菌BL21中,通过对诱导条件的优化,发现在37℃、0.4mMIPTG浓度诱导5h后获得较高产量的可溶性重组蛋白,经过镍柱纯化和脱盐处理后得到了高纯度的重组蛋白,并经Westernblot证明其为目的蛋白。