【摘 要】
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目的:构建GLP-1重组毕赤酵母,筛选出高表达rGLP-1的重组毕赤酵母株,优化rGLP-1表达条件和建立纯化工艺,鉴定纯化后的rGLP-1纯度和生物活性.方法:通过PCR方法获得的GLP-1基因
【出 处】
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中国协和医科大学 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部
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目的:构建GLP-1重组毕赤酵母,筛选出高表达rGLP-1的重组毕赤酵母株,优化rGLP-1表达条件和建立纯化工艺,鉴定纯化后的rGLP-1纯度和生物活性.方法:通过PCR方法获得的GLP-1基因片段,经Not Ⅰ酶切后,插入到质粒pPIC9K中.重组的GLP-1-pPIC9K质粒转化毕赤酵母GS115后,通过His-和G418平板筛选高表达菌株.设定四个不同的甲醇浓度,研究其对rGLP-1表达量的影响,同时研究了诱导时间的变化对rGLP-1表达量的影响.应用反相层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析对rGLP-1进行纯化.并用SDS-PAGE和HPLC对纯化后的rGLP-1纯度进行鉴定.使用RINm5F细胞检测纯化后的rGLP-1体外促进胰岛素分泌的活性.建立2型糖尿病大鼠模型,并在此模型中对rGLP-1的体内降血糖作用进行研究.结果:1、成功构建了重组GLP-1毕赤酵母.2、筛选出高表达rGLP-1的重组GLP-1毕赤酵母株.3、证实在1%的甲醇浓度和诱导三天时,rGLP-1表达量最高.4、优化出的纯化工艺:离心→反相层析→阴离子交换层析→凝胶过滤→冻干.5、纯度鉴定认为rGLP-1 SDS-PAGE未见其他杂带,HPLC证实纯化的rGLP-1纯度达到97%.6、纯化后的rGLP-1在体外可以明显促进RINm5F细胞分泌胰岛素,7、体内实验证实rGLP-1可以降低糖尿病大鼠血糖至正常水平.结论:获得了高表达rGLP-1的重组GLP-1毕赤酵母株,优化了rGLP-1的表达条件.建立了纯化工艺,rGLP-1纯度达到97%.所获得的rGLP-1较好的生物活性.
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