两栖动物的变态过程受甲状腺激素（THs）精确调控。一些环境胁迫因子（如温度、高氯酸盐和外源性T4）已被证明可干扰甲状腺激素的正常活性,进而影响两栖动物的生长发育。温度是一种非生物因子,可通过改变甲状腺激素水平影响两栖动物的生长发育。一般而言,两栖动物在较高温度下比在较低温度下的生长速率更快、幼体期更短。高氯酸盐是一类化学污染物,可以通过抑制钠碘转运体有效减少或阻止甲状腺激素合成,从而影响两栖动物的生长发育。另外,在水体中的添加外源性甲状腺激素T4可增加蝌蚪体内的甲状腺激素水平,并过早地诱发蝌蚪变态。已有研究表明,上述环境胁迫因子可以通过改变甲状腺激素水平从而影响两栖动物的生长发育。骨骼在身体支撑、器官保护和矿物质的储存中起着至关重要的作用。在两栖动物的生活史中,四肢骨骼的发育能够帮助两栖动物完成从水生环境到陆生环境的转化。大多数骨骼是通过软骨内骨化过程形成的,该过程是由系统因子、转录因子以及局部分泌因子等许多特定分子和软骨细胞分泌的胞外基质（ECM）成分精密调控的。甲状腺激素（THs）属于一种系统因子,可在软骨组织中调控软骨细胞的增殖、肥大以及凋亡。Runt相关转录因子（Runx）调控早晚期成骨细胞和软骨细胞的分化。血管内皮生长因子（VEGF）是一种局部分泌因子,与其受体（VEGFR）结合可以促进血管进入到软骨组织中。而基质金属蛋白酶（MMPs）直接参与胞外基质的重塑。然而,温度、高氯酸盐和外源性T4这些环境胁迫因子是否可以通过改变甲状腺激素水平来影响两栖动物骨骼发育,其报道并不多见。本文以中华大蟾蜍蝌蚪（Bufo gargarizans）为研究对象,探讨温度、高氯酸盐和外源性T4等环境胁迫因子能否通过改变甲状腺激素水平来影响蝌蚪的软骨内骨化过程。本实验内容包括两部分,第一,探讨温度对蝌蚪生长发育以及软骨内骨化过程的影响。将Gs28-Gs46期蝌蚪分别置于15℃、22℃和29℃ 3种水温下饲养,检测温度对Gs40、Gs42和Gs46期蝌蚪的存活、生长发育、变态时间以及骨骼骨化的影响,并通过HE染色检测不同温度下Gs42期蝌蚪甲状腺组织结构的改变。此外,通过RT-qPCR技术检测温度对Gs42期蝌蚪后肢软骨内骨化相关基因表达水平的影响。第二,探讨高氯酸盐和外源性T4对蝌蚪生长发育以及软骨内骨化过程的影响。分别将Gs28期蝌蚪持续暴露在250μg/L NaClO4和10μg/L T4溶液中,至Gs46期。通过形态学测量法分析Gs40、Gs42和Gs46期蝌蚪存活、生长发育以及变态时间情况,并检测Gs42期蝌蚪甲状腺组织特征。通过阿利新兰-茜素红骨骼双染色技术检测250μg/L NaClO4和10μg/L T4对Gs40、Gs42和Gs46期蝌蚪骨化程度的影响。此外,还分析了这两种药物对蝌蚪后肢软骨内骨化相关基因表达水平的影响。研究结果及结论如下:第一部分:1.形态测量显示,与适温相比（22℃）,高温（29℃）显著降低蝌蚪的全长、体长、体重以及后肢长度,并加速了变态。而低温（15℃）显著增加蝌蚪的全长、体长、体重以及后肢长度,并延迟了变态。表明温度可影响中华大蟾蜍蝌蚪的生长发育。2.甲状腺组织病理学检测显示,高温暴露显著减少甲状腺组织中的胶体区域面积,而低温显著增加甲状腺组织中的胶体区域面积。由于甲状腺滤泡中的胶体含量决定着甲状腺激素的分泌能力,表明高温可以增加蝌蚪的甲状腺激素分泌量,而低温降低了甲状腺激素分泌量。3.阿利新兰-茜素红骨骼双染色显示,高温和低温处理均抑制蝌蚪的骨化。蝌蚪后肢骨骼在适温下骨化程度最高,其次是低温,最后是高温。由于已有研究证明甲状腺激素能够影响蝌蚪骨骼发育。表明甲状腺激素水平过度增加或减少均可能会抑制蝌蚪的骨化。4.RT-qPCR结果显示,高温和低温均显著下调软骨内骨化相关基因TRβ、MMP9、MMP13和Runx3基因的表达水平,而显著上调Runx2、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFR-1、VEGFR-2以及VEGFR-3基因的表达水平。结果表明温度可能抑制蝌蚪的软骨内骨化过程。第二部分:5.形态测量显示,250μg/L NaClO4导致蝌蚪的体型增大,并延迟其发育。而10μg/LT4导致蝌蚪的体型减小,诱发其提前变态,并显著降低其存活率。此外,250μg/L NaClO4和10μg/L T4抑制蝌蚪后肢的生长。结果表明高氯酸盐和外源性T4可能会影响蝌蚪的生长发育。6.组织病理学结果显示,250μg/L NaClO4处理显著减少甲状腺组织中的滤泡大小和滤泡上皮细胞高度,并导致滤泡上皮细胞增生。而甲状腺大小、滤泡大小、胶体面积、滤泡上皮细胞高度和滤泡数目在10μg/LT4处理组中是显著减少的。表明高氯酸盐和外源性T4造成了蝌蚪甲状腺组织的损伤。7.骨骼双染色结果显示,250μg/L NaClO4和10μg/L T4抑制蝌蚪的骨化程度。在Gs46期时,对照组蝌蚪后肢骨骼完全骨化,而250μg/LNaClO4和10μg/LT4处理组蝌蚪后肢骨骼并未完全骨化。已有研究证实高氯酸盐可以通过抑制钠碘转运体有效地减少蝌蚪中的甲状腺激素水平,而直接添加外源性T4可以增加蝌蚪的甲状腺激素水平。这表明甲状腺激素水平的增加或减少可能会抑制蝌蚪的骨化。8.RT-qPCR结果表明,250μg/L NaClO4和10μg/L T4处理均能显著改变蝌蚪后肢软骨内骨化相关基因的表达水平。250μg/L NaClO4和10 μg/LT4均显著下调MMP9、MMP13和Runx3基因的表达水平。250μg/L NaClO4显著下调TRβ、Dio2和Dio3基因的表达水平,而10μg/L T4显著上调Runx1、Runx2、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、TRα、TRβ、Dio2 以及 Dio3基因的表达水平。结果表明高氯酸盐和外源性T4可能抑制蝌蚪的软骨内骨化过程。综上所述,本实验的结果首先证明温度、高氯酸盐和外源性T4等环境胁迫因子可以影响中华大蟾蜍蝌蚪的生长发育,造成甲状腺组织的损伤,并抑制蝌蚪的骨化。进一步的检测结果表明,温度、高氯酸盐和外源性T4可能是通过改变甲状腺激素水平来抑制中华大蟾蜍蝌蚪的软骨内骨化。这些结果将为深入研究环境胁迫因子对两栖动物骨骼发育影响的机制提供科学依据。