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第一部分脓毒症急性肺损伤动物模型的建立与人脐带间充质干细胞的培养、鉴定目的:构建稳定的急性肺损伤(ALI)小鼠模型,为后期人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)治疗ALI模型做必要的前期准备。建立可靠、稳定的细胞传代、培养、鉴定的操作方法,为下一步HUC-MSCs的临床前及临床试验奠定基础。方法:将48只SPF级C57BL/6小鼠,随机分成2组(每组n=24)。以10%水合氯醛(3ml/kg)注入小鼠腹腔,约5分钟麻醉后,对照组:行气管暴露手术,气管插管,气管内滴入PBS30μl;模型组:行气管插管术,滴入LPS(5.0mg/kg)溶液30μl构建ALI模型。观察各组小鼠生存率及体重的变化,分别在处理后第1、3、5天处死,并收集标本,观察小鼠肺湿/干重比变化,肺病理组织损伤评分变化,检测小鼠支气管肺泡灌洗液中总蛋白水平及TNF-ɑ、IL-6、IL-10等细胞因子水平。用贴壁培养法对HUC-MSCs进行培养传代。按照2:1的比例进行传代培养,每三天半量更换培养液。流式细胞仪检测第四代(P4)代HUC-MSCs细胞表面抗原CD73,CD105,CD90,CD34,CD45,HLA-DR表达;P4代HUC-MSCs贴壁生长48h后,分别加入HUC-MSCs成骨细胞、成脂细胞与成软骨细胞诱导培养液进行培养,分别用茜素红染色、油红O染色、阿新蓝染色进行鉴定,并观察细胞的成骨、成脂、成软骨分化能力。结果:与对照组相比,模型组小鼠在第二天开始食量明显减少,活动量减低,对外界刺激反应降低,体重开始降低,死亡率增高(P<0.05);ALI模型组随造模后,肺W/D明显增大(P<0.05);模型组肺组织大体观察明显充血,肿胀,表面可见出血点,光镜下肺组织呈实变改变,可见:肺间质增宽,炎性细胞浸润,肺泡腔内有渗出液,病理组织损伤评分明显增高(P<0.05);ALI模型组BALF总蛋白水平明显升高(P<0.05),模型组各时间点各个细胞因子,促炎因子TNF-α、IL-6,抗炎因子IL-10浓度较对照组均有明显升高(P<0.05)。HUC-MSCs细胞表面抗原CD73、CD105、CD90、CD34、HLA-DR、CD45,利用流式细胞仪检测表达率分别是99.97%,99.89%,99.81%,0.14%,0.08%,0.17%,其细胞表面标志物的表达情况与HUC-MSCs特征完全一致。成骨诱导:连续培养第14天,用茜素红染色,白色钙结节呈铁锈红着色,对照组均未见着色。成脂诱导:诱导培养一周左右,可见细胞胞质中有脂滴形成,连续培养第14天,进行油红O染色,脂滴染为红色。成软骨诱导:将细胞团小心悬浮于培养液中进行诱导培养,连续培养四周,行阿新蓝染色,软骨组织被染成蓝色。结论:成功利用气管内滴入LPS建立稳定的ALI小鼠模型;利用贴壁细胞培养法稳定培养出合格的HUC-MSCs细胞,为后续研究与实验奠定基础。第二部分人脐带间充质干细胞对急性肺损伤模型的治疗作用目的:研究HUC-MSCs对ALI小鼠模型的治疗作用与安全性。方法:将96只C57BL/6小鼠随机分成4组(每组n=24)。所有小鼠均以3ml/kg水合氯醛腹腔麻醉后,经口行气管插管术。空白对照组:气管内滴入PBS30μl,1h后再次滴入PBS60μl;对照组:气管内滴入PBS30μl,1h后滴入HU-MSCs60μl(内含HU-MSCs5×105个);模型组:气管内滴入LPS30μl(内含LPS5mg/kg)构建ALI模型,1h后再次滴入PBS60μl;治疗组:气管内滴入LPS30μl(内含LPS5mg/kg),1h后滴入HU-MSCs60μl(内含HU-MSCs5×105个)。观察各组小鼠体重、生存率的变化,分别在处理后第1、3、5天处死,并收集标本,观察小鼠肺湿/干重比变化,肺病理组织损伤评分变化,检测小鼠BALF中总蛋白及TNF-ɑ、IL-6、IL-10等细胞因子水平。结果:对照组在小鼠气管内移植了HUC-MSCs后1天、3天、5天与空白对照组在各个时间点上进行对比,BALF中TNF-α、IL-6、IL-10及总蛋白水平;肺病理组织损伤评分;其湿/干重(W/D)比值;体重及生存率等方面均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,治疗组在HUC-MSCs移植后,死亡率较模型组明显降低,体重从移植后第三天开始逐渐恢复(P<0.05);治疗组在HUC-MSCs移植后,肺组织湿/干重(W/D)比值在各个时间点较模型组均有明显降低(P<0.05);治疗组与模型组相比,在各个时间点肺水肿、肺间质内粒细胞浸润均明显减轻,肺病理组织损伤评分可见治疗组在各时间点评分均较模型组明显降低,P<0.05);治疗组在移植HUC-MSCs后,在各个时间点其BALF中总蛋白水平均较模型组明显降低(P<0.05);治疗组在移植HUC-MSCs后,促炎因子TNF-α和IL-6较模型组显著降低(P<0.05),而抗炎因子IL-10较模型组显著升高(P<0.05)。结论:早期给予HUC-MSCs可有效治疗ALI小鼠,可显著改善小鼠预后;HUC-MSCs异体移植小鼠后未发现明显的不良反应。第三部分人脐带间充质干细胞治疗儿童ARDS的Ⅰ期临床研究目的:探究HUC-MSCs对治疗儿童急性呼吸窘迫综合症(PARDS)病人的安全性。方法:将2015年7月至2017年6月入住重庆儿童医院重症监护病房及课题合作医院重症监护病房符合入选标准的PARDS病人纳入本研究。研究期间共一例创伤性PARDS患儿纳入研究。患儿入院后均在纠正基础疾病的基础上,给予充分氧疗,纠正电解质紊乱及酸碱失衡,并予机械通气支持治疗。予以1×107 HUC-MSCs一次性输注,观察患儿移植前后临床症状体征,收集患儿移植前后的血常规、肝肾功等生化全套、免疫球蛋白、细胞免疫、肺部CT,记录上机时间、脱机时间、血管加压药使用天数、转出ICU时间等。结果:该患儿移植HUC-MSCs后出现了一次一过性发热(38.6℃)外,其他从症状到体征,血液生化、血常规、免疫功能检测等方面,均未发现HUC-MSCs对该患儿造成了不良影响,移植前后胸部影像学检查也未发现肺不张或实变加重的情况。连续观察19个月,未发现移植物抗宿主病(GVHD)及肿瘤的发生,生长发育也未受到影响。结论:HUC-MSCs移植对这例创伤性PARDS的治疗是安全的,需扩大纳入研究的PARDS病例数量加以证实。第四部分人脐带间充质干细胞治疗儿童难治性肺疾病的临床研究目的:探究HUC-MSCs治疗儿童难治性肺疾病的安全性及有效性。方法:将2015年12月至2017年6月入住重庆儿童医院,明确诊断为支气管肺发育不良(BPD)、闭塞性细支气管炎(BO)、肺纤维化(PF)的患儿,经过常规治疗效果不佳,经患儿家长同意并签署知情同意书,符合入选标准的难治性肺疾病患儿纳入本研究。共有8名患儿纳入研究,根据病情给予2-3次不等的HUC-MSCs移植,剂量为1×107/10kg。密切观察患儿一般情况,及有无不良反应,收集患儿移植前后的血常规、肝肾功、免疫球蛋白、细胞免疫、病毒性肝炎血清标志物、梅毒血清学、HIV抗体、动脉血气分析、肺功能、肺部CT等临床与实验室资料,评估其安全性与有效性。结果:8名接受HUC-MSCs移植的患儿体温、呼吸、脉搏在观察过程中,均在正常范围内波动;移植患儿在移植后均未出现皮肤瘙痒、肌肉疼痛、头痛、视物模糊、呕吐、腹痛等一般不良症状,也未出现皮疹、黄疸等一般不良反应的体征。患儿未出现休克、器官功能衰竭、死亡。移植前后的大小便常规检查均正常;梅毒血清学、病毒性肝炎血清标志物、HIV抗原抗体在移植前及移植后3个月检测对比,均无异常改变。所有患儿移植前后血常规、肝肾功、心肌酶谱、乳酸检测,均无明显变化(P>0.05)。移植前后的体液免疫和细胞免疫检测结果均无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。8例患儿接受了HUC-MSCs移植后,8例患儿其临床症状在移植后24小时内有所改善,行动脉血气分析检测,发现其PO2有明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),但移植后1月复查动脉血气PO2回复至移植前水平,差异无统计学意义(P>0.05);移植前后的胸部CT结果除1例PF患儿无明显变化外,其余BPD及BO患儿病变有显著改善,CT评分差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HUC-MSCs治疗儿童难治性肺疾病近期安全性好,远期安全性有待进一步观察;目前我们的小样本研究结果提示HUC-MSCs对部分儿童难治性肺疾病有效,还需要进一步扩大样本、多中心的临床研究证实。