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猪瘟分布于是世界各地,在国内广泛流行,给养猪业造成严重的经济损失。长期的疫苗使用,造成病毒发生变异,呈现多种病型的发生。猪瘟病毒建立了一种逃避宿主先天性免疫系统识别的策略,免疫系统不能识别非自我元件而导致免疫耐受,造成猪的持续性感染。猪瘟病毒E吣蛋白能诱导产生中和抗体,在病毒的持续性感染和抗病毒应答过程中发挥重要功能作用,NS4A、NS4B、NS5A参与病毒RNA的复制过程,四种蛋白Erns、NS4A、NS4B和NS5A在对宿主的致病过程中扮演着重要角色,研制猪瘟病毒各种蛋白的抗体有助于对病毒蛋白的结构与功能的深入探讨,因此本研究通过制备结构蛋白Erns和非结构蛋白NS4A、NS4B和NS5A的多克隆抗体,进一步探索感染细胞中猪瘟病毒Erns、NS4A、NS4B、NS5A蛋白与宿主的相互作用关系。本文克隆了Erns、NS4A、NS4B△205-347、NS5A基因,将这些基因插入原核表达载体PET-32a(+)克隆位点,成功构建了PET-Erns、PET-NS4A. PET-NS4B△205-347、PET-NS5A重组原核表达质粒。将重组质粒转化BL-21或BL一21衍生菌并进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot分析显示Erns、NS4A、NS4B△205-347和NS5A基因得到了有效表达,Erns、NS4A、NS5A重组蛋白主要以包涵体的形式表达,而NS4B△205-347重组蛋白能以包涵体和可溶性蛋白两种形式进行表达。Erns、NS4A、NS5A包涵体在变性条件下,通过Ni2+的亲和层析法纯化蛋白,纯化的蛋白经逐步透析法进行复性重折叠,获得有活性的免疫原。NS4B△205-347可溶性蛋白不需经变性就可经Ni2+的亲和层析纯化获得有活性的蛋白。以制备的Erns、NS4A、NS4BA205-347、NS5B重组活性蛋白作为抗原按免疫程序免疫四周龄小鼠,获取抗这四种蛋白的多克隆抗体。Western Blot分析显示：抗Erns、NS4A、NS4BΔ205-347和NS5A重组蛋白的多克隆抗体能分别与相应的重组蛋白发生良好反应；PK-15细胞中真核表达融合GFP蛋白的NS4B蛋白,抗NS4BΔ205-347的多克隆抗体能特异地识别NS4B-GFP融合蛋白；抗NS5A蛋白的多克隆抗体能与PK-15细胞真核表达的NS5A-GFP融合蛋白特异性结合；NS4A、NS5A多抗能分别特异性地检测到CSFV感染PK-15细胞中的NS4A、NS5A蛋白。对感染CSFV的PK-15细胞的间接免疫荧光抗体试验显示：抗Erns、NS4A、NS4B Δ205-347、NS5A重组蛋白的抗体能分别与CSFV的Erns、NS4A、NS4B、 NS5A蛋白发生反应,具备良好的敏感性与特异性,同时也表明这些抗体能检测到CSFV的Erns、NS4A、NS4B、NS5A亚细胞定位于PK-15细胞胞质中。