ABA(abscisic acid)是一种经典的植物激素,调节植物体内多种生理过程,在植物响应环境胁迫中起着重要的作用。有研究证明Ca2+/CaM参与叶片中ABA诱导的抗氧防护过程,然而尚不清楚Ca2+/CaM依赖型蛋白激酶(CCaMK)是否参与这一过程。本实验前期在水稻叶片中找到了一个CCaMK基因,OsDMI3 (does not make infection3)。在水稻叶片中,H2O2、ABA以及PEG能够诱导OsDMI3基因表达和激酶活性的上升。本文调查水稻中OsDMI3在ABA诱导的抗氧化防护中的作用以及其作用机制,主要结果如下：为了确定OsDMI3能够参与ABA诱导的抗氧化防护途径,构建了OsDMI3的瞬时表达载体,合成了OsDMI3的dsRNA干扰片段。利用水稻原生质体瞬时表达体系,瞬时表达和沉默OsDMI3,证明其能够其诱导抗氧化防护酶SOD和CAT的表达,并参与ABA诱导的H2O2的积累,提高了细胞的抵抗胁迫的能力。为了更好的研究OsDMI3在ABA诱导的抗氧化防护中的作用,利用酵母双杂交系统,以OsDMI3全长为诱饵筛选水稻叶片cDNA文库寻找其在ABA信号中的靶蛋白。将筛选得到的阳性克隆回复验证、测序、比对,得到了一个与OsDMI3目互作用的蛋白-OsBiPP2Cl (BTH induced protein phosphatase 2C 1) 。 OsBiPP2Cl属于蛋白磷酸酶PP2C家族,其C端具有保守的PP2C激酶结构区,N端含有较长的延伸区。OsBiPP2Cl的CDS区全长1710bp,编码的蛋白有569Aa。由于酵母双杂系统具有一定的假阳性,为了进一步验证OsBiPP2Cl和OsDMI3的相互作用的真实性,采用BiFC (Bimolrcular fluorescence complementation), GST pull-down, Co-IP (Co-immunoprecipitation)从体内体外进行了验证。结果表明OsBiPP2Cl和OsDMI3无论在体内还是体外均存在互作。同时利用水稻原生质体瞬时表达体系观查OsBiPP2Cl的亚细胞定位。发现OsBiPP2Cl 和 OsDMI3一样,均定位存在于细胞核、细胞质和细胞膜上。OsBiPP2Cl是蛋白磷酸酶,具有可逆的磷酸化作用,我们在水稻叶片总蛋白中用激酶反应体系检测体外翻译的OsBiPP2C1对OsDMI3激酶活性的影响。实验发现OsBiPP2Cl能够抑制OsDMI3的激酶活性。通过Y2H, BiFC, Co-IP的方法证明了OsBiPP2C1和 OsDMI3的相互作用受ABA的影响。ABA能够解除两者之间的相互作用。拟南芥中,PP2C家族多数为ABA信号途径中的负调控因子。通过检测水稻叶片中OsBiPP2C1的基因表达和酶活的变化,发现OsBiPP2C1也是一个ABA信号途径中的负调控因子。ABA处理的短时间内,OsBiPP2C1的基因表达和酶活均能被ABA抑制。ABA能够抑制OsBiPP2C1的磷酸酶活性,使其活化OsDM13,将ABA信号传递给OsDMI3。由于OsDMI3受到ABA诱导的H202的调控,为了进一步研究OsBiPP2C1在ABA信号途径中的位置。我们利用荧光定量PCR和磷酸酶酶活检测的方法探讨了水稻叶片中OsBiPP2C1和H2O2的关系,发现OsBiPP2C1受H2O2抑制。通过Co-IP的方法检测到叶片中OsDMI3和OsBiPP2C1的相互作用是受H202的调控。ABA诱导的H2O2的产生,从而使得OsBiPP2C1的去磷酸化作用消失,两者的相互作用解除,OsDMI3被磷酸化。OsDMI3能够诱导ABA途径中的抗氧化酶活性的增加,而通过水稻原生质体瞬时表达体系则发现OsBiPP2C1具有相反的作用,进一步的证明OsBiPP2C1是ABA信号途径中负调控因子。同时我们也检测了瞬时表达和沉默OsBiPP2C1对原生质体内ROS产生的影响来初步判断OsBiPP2C1在ABA诱导的抗氧化防护途径的作用。我们推测正常条件下,OsDMI3和 OsBiPP2C1相互作用,OsBiPP2C1抑制OsDMI3的激酶活性使得OsDMI3处于失活状态。当外界胁迫刺激植物细胞内ABA的含量增加,导致细胞内H202的产生,抑制了OsBiPP2C1的磷酸酶活性,活化了OsDMI3, OsDMI3将ABA信号传递给下游的抗氧化防护酶,刺激细胞积累ROS,使细胞开启了抗氧化防护机制来抵御外界的胁迫。当植物细胞内清除了多余的ROS后, OsBiPP2C1的活性又得到了恢复,重新和OsDMI3相互作用,去磷酸化OsDMI3。OsBiPP2C1是ABA调控OsDM I3活性启动抗氧化防护机制的开关。