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目的: 观察人肺腺癌A549细胞在乏氧/(乏氧+饥饿)环境下,加入不同浓度抗血管生成药物贝伐单抗(bevacizumab,Bev)或小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂E109后,其形态、增殖、侵袭、迁移力改变情况,通过第二代测序技术,寻找高浓度贝伐单抗使人肺腺癌A549细胞生物学行为发生改变的"活化基因"、并与E109比较,以寻找克服抗血管生成耐药的方法. 方法: 采用Billups-rothenberg细胞乏氧装置,充入混合气体(1%O2+5%CO2+94%N2)建立体外乏氧模型;采用MTT方法检测不同浓度贝伐单抗及E109在乏氧/(乏氧+饥饿)环境下对人肺腺癌A549细胞增殖活性的影响;采用流式细胞术检测贝伐单抗在乏氧/(乏氧+饥饿)环境下对人肺腺癌A549细胞细胞周期的影响;采用Transwell方法检测不同浓度贝伐单抗以及E109在乏氧/(乏氧+饥饿)环境下对人肺腺癌A549细胞侵袭和迁移能力的影响;采用二代测序技术,对乏氧/(乏氧+饥饿)环境下的对照组和高浓度贝伐单抗处理组(80μg/ml和160μg/ml)进行转录组水平的测序,分析和筛选所得数据,寻找出处理组与对照组差异明显的基因补体应答基因32(RGC32);采用real-time PCR方法对筛选出来的补体应答基因32(RGC32)在mRNA水平上进行进一步的验证;采用Western blot方法检测补体应答基因32(RGC32)、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、转录因子snail、基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达水平. 结果: 1.MTT法检测结果显示:①乏氧环境下,贝伐单抗药物增加到一定浓度后,对人肺腺癌A549细胞抑制率随着浓度的增加而增加,但差异不具有统计学意义(P>0.05).在乏氧+饥饿环境下,贝伐单抗药物增加到一定浓度后,对人肺腺癌A549细胞抑制率随着其浓度的增加而增加,差异具有统计学意义.同时,两个培养环境下,在较低浓下的贝伐单抗药物作用下,都会出现一个抑制率先下降,然后随着浓度的进一步增加而增加的趋势.②在乏氧及乏氧+饥饿环境下,E109作用人肺腺癌A549细胞24h或者48h后,细胞抑制率随着浓度的增加而增加,且差异具有统计学意义. 2.细胞周期检测结果显示:在乏氧或者乏氧+饥饿的培养环境下,将药物浓度80μg/ml的贝伐单抗和药物浓度160μg/ml贝伐单抗分别作用于人肺腺癌A549细胞24h后,与对照组相比,G0/G1期细胞比例减少,S比例增加,但是差异不具有统计学意义(P>0.05).乏氧环境下,药物浓度80μg/ml的贝伐单抗和药物浓度160μg/ml贝伐单抗作用人肺腺癌A549细胞48h后,G0/G1期细胞比例减少,S比例增加,但是差异没有统计学意义(P>0.05). 3.Transwell侵袭迁移实验结果显示:①较高浓度贝伐单抗药物(80μg/ml组和160μg/ml组),在乏氧或者乏氧+饥饿环境下作用于人肺腺癌A549细胞48h后,与对照组和较低浓度的贝伐单抗药物(20μg/ml组)相比,能明显促进肿瘤细胞侵袭和迁移能力,差异具有统计学意义.②E109在乏氧或者乏氧+饥饿环境下作用人肺腺癌A549细胞,随着药物浓度的增加,细胞迁移能力下降,差异具有统计学意义. 4.二代测序结果显示:在乏氧/(乏氧+饥饿)培养环境下,高浓度贝伐单抗80μg/ml组及160μg/ml组与对照组相比,补体应答基因32(RGC32)明显上调,差异具有统计学意义. 5.Real-time PCR方法验证二代测序结果示:①在乏氧/(乏氧+饥饿)培养环境下,高浓度贝伐单抗80μg/ml组及160μg/ml组与对照组以及贝伐单抗低浓度20μg/ml组相比,补体应答基因32(RGC32)明显上调,差异具有统计学意义.②E109在乏氧环境下作用人肺腺癌A549细胞,随着药物浓度的增加,补体应答基因32(RGC32)mRNA表达水平明显下调,差异具有统计学意义;而在乏氧+饥饿环境下作用人肺腺癌A549细胞,着药物浓度的增加,补体应答基因32(RGC32)mRNA表达水平明显上调,差异具有统计学意义. 5.Western blot检测结果示:①在乏氧/(乏氧+饥饿)培养环境下,高浓度贝伐单抗(80μg/ml组及160μg/ml组)与对照组及低浓度贝伐单抗低(20μg/ml组)相比,补体应答基因32(RGC32)蛋白水平明显上调,且上皮间质转化相关指标-上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)表达水平下调、转录因子snail+slμg以及基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达水平明显上调.②E109在乏氧/(乏氧+饥饿)环境下作用人肺腺癌A549细胞,随着药物浓度的增加,补体应答基因32(RGC32)蛋白表达水平明显下调,且上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)表达水平上调,转录因子snail+slμg以及基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达水平明显下调. 结论: 1.高浓度贝伐单抗在乏氧以及乏氧+饥饿环境下可增加人肺腺癌A549细胞迁移、侵袭能力,导致其生物学行为恶性改变. 2.在乏氧以及乏氧+饥饿环境下,随着小分子酪氨酸激酶抑制剂E109浓度的增加,A549细胞增殖、迁移能力明显下降. 3.高浓度贝伐单抗在乏氧以及乏氧+饥饿环境下可能通过上调RGC32基因mRNA以及蛋白水平的表达,进一步调节EMT相关指标的表达,促进人肺腺癌A549细胞生物学行为的恶性改变.