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目的:本研究拟通过体外细胞实验研究去甲斑蝥素(NTCD)联合槲皮素(QUE)对膀胱癌细胞的凋亡与增殖抑制作用及其机制,为治疗人膀胱肿瘤提供新的中药复方剂型。方法:体外实验部分:通过使用不同药物浓度的去甲斑蝥素联合槲皮素作用人膀胱癌T24细胞和鼠MB49细胞进行体外培养,取不同作用时间的细胞进行LDH释放实验,检测药物对两种膀胱癌细胞的直接细胞毒作用,并计算凋亡率和坏死率,进而筛选出两药联合抑制膀胱瘤细胞的最佳药物浓度和作用时间。FCM检测最佳药物浓度两药联合对T24细胞周期和凋亡的影响;分光光度法检测caspase-3、8、9活性变化;Western blot法检测Bcl-2、Bax及survivin表达变化;酶联免疫法检测去甲斑蝥素联合槲皮素通过免疫细胞介导的间接细胞毒作用。动物实验部分:建立Bcl/6小鼠膀胱癌皮下种植瘤模型,联合组用筛选出的最佳复合药物浓度进行瘤旁皮下注射,同时设立单药组和阴性对照。期间观察小鼠的生存状态和肿瘤生长情况,2W后切取肿瘤称重并计算抑瘤率,对组织标本切片行HE染色并于镜下行常规病理观察。10倍最佳抑制细胞增殖浓度的NTCD联合QUE行小鼠腹腔注射及膀胱灌注,观察对小鼠心、肝、脾、肺、肾、膀胱等重要脏器的影响。结果:(1)NCTD和QUE在体外对人膀胱癌T24细胞和鼠MB49细胞均有明显增殖抑制作用,两药联合应用对膀胱癌细胞的促凋亡作用明显强于单药(p<0.05),在一定时间一定浓度范围内呈时间-浓度效应关系,最佳两药联合浓度为NCTD 60umol/L+Que 100umol/L;(2)流式细胞计数也证实两药联合应用对膀胱癌细胞的凋亡率明显强于单药,NCTD和QUE分别阻滞细胞于G2/M期期和S期,两药联合后多集中于G2/M期;(3)分光光度法检测caspase-3、8、9酶活性逐渐增加,24h caspase-3最先达到高峰,而caspase-8、caspase-9出现高峰时间为36h,其中caspase-8活性较caspase-9活性高;(4)Western blot显示单药组和两药联合组T24细胞与阴性对照组相比Bcl-2表达减弱,Bax表达增强,survivin表达增强,但联合组作用更明显;(5)酶联免疫法检测两药联合对TNF-a的作用发现,与阴性对照组相比,单药NCTD组可明显增加TNF-a的释放,而QUE,甚至比阴性对照组偏低,联合组促进TNF-α释放的作用明显优于QUE组和阴性对照组,(P<0.05),但低于NCTD组;对IL-2刺激作用发现随着药物作用时间的延长,联合组对TNF-a的刺激作用也逐渐增强,24h高出阴性对照组2倍,与单药组和阴性对照组比较差异显著(P<0.05),随后一直维持较高水平。(6)Bcl/6小鼠膀胱癌皮下种植瘤瘤周注射,单药组抑瘤率NCTD和QUE分别为28%和32%,两药联合组抑瘤率高达48%。(7)安全性分析中,10倍细胞最佳药物浓度NTCD联合QUE腹腔注射及膀胱灌注,小鼠一般情况好,重要脏器病理切片染色未见明显明显损害。结论:NCTD和QUE在体外对人膀胱癌T24细胞和鼠MB49细胞均有明显增殖抑制作用,两药联合应用对膀胱癌细胞的促凋亡作用明显强于单药(p<0.05),在一定浓度和时间范围内呈时间-效应关系和浓度-效应关系,于细胞周期的G2/M有阻滞作用。其作用机理可能与激活caspase-3、caspase-8、caspase-9,Bcl-2减弱,Bax和survivin增强有关;两药联合可促进TNF-a和IL-2免疫因子的释放;动物实验分别进行了BCL/6小鼠膀胱癌皮下种植瘤模型安全性和有效性分析,证实Bcl/6小鼠膀胱癌皮下种植瘤模型造模简洁高效。两药联合皮下注射具有明显的抗小鼠膀胱肿瘤作用,其作用机制可能为诱发肿瘤细胞凋亡;10倍正常剂量下NCTD联合QUE腹腔注射无明显毒副作用,未见明显的脏器损害。