一、研究背景：宫腔粘连(intrauterine adhesions, IUA)是指各种原因的创伤,如刮宫、感染、电灼等导致子宫内膜基底层损伤,子宫壁瘢痕愈合,使宫腔和(或)宫颈管腔闭锁,子宫失去原有生理功能的一种疾病。该病最早于1894年报道,1948年Asherman首次系统的报道了流产和产后刮宫导致的宫腔粘连病例,并将该病命名为“损伤性闭经(traumatical amenorrhea)"。IUA的症状主要有闭经、痛经、不孕,即使通过治疗后成功自然妊娠,患者于孕期也容易发生流产、早产、胎盘粘连、产后出血、胎儿宫内发育迟缓、胎儿畸形等严重的产科并发症,给患者带来经济及心理负担的同时,也给医务工作者带来了严峻的考验。IUA的发病原因多为人工流产、早孕及中晚孕期清宫术、宫腔镜手术等造成。IUA的发病机制尚不清楚,研究假说众多,如纤维化增生过度学说、神经反射学说、子宫内膜干细胞分化异常等,研究最为广泛的当属纤维化增生过度学说。IUA的病理学改变包括子宫内膜组织纤维化、子宫内膜腺体减少,这与纤维化性疾病相同,把IUA视为纤维化性疾病研究也是IUA治疗的重要突破口。IUA的诊断方法主要依靠宫腔镜检查,在直视下能全面评估宫腔形态、子宫内膜分布及损伤程度,是诊断IUA的准确方法及首选方法。其他的诊断方法,如子宫输卵管碘油造影、超声及MRI检查的益处不明显。目前没有任何一种方法可以单独有效的治疗IUA,主要采用综合性治疗。包括：宫腔镜下宫腔粘连分离术(transcervical resection of adhesions, TCRA);术中宫腔放置宫内节育器、宫腔支撑球囊、生物胶类材料的应用等；术后补充雌激素,促进子宫内膜的生长与再生,有助于创面修复。在众多的辅助治疗中,雌激素的补充作为经验性的治疗被国内外学者广泛应用,雌激素除了对子宫内膜特有的生理作用外,在肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化等众多纤维化性疾病中,也展现出了有效的抗纤维化作用,这使得雌激素在IUA中的作用更为值得期待。在IUA中,术后应用雌激素预防粘连复发、促进子宫内膜修复这一举措已成为共识。虽然国内外的临床医生及学者均在应用雌激素治疗IUA,但因治疗效果不一,基础研究还不深入,故存在着广泛的争议。争议点主要集中在雌激素的应用剂量上,国内外众多的临床试验显示,TCRA术后应用大剂量雌激素对预防IUA的复发及术后月经恢复、提高妊娠率均具有显著效果。也有研究显示TCRA术后应用大剂量雌激素反而会加重IUA的病情。然而由于这些试验临床病例少,地域限制明显,再加上大样本多中心的前瞻性队列研究开展困难,因此在TCRA术后应用雌激素的剂量问题上还有待做进一步的基础和临床研究。戊酸雌二醇(estradiol valerate, E2V)是目前宫腔粘连分离术后应用雌激素最常用的雌激素制剂,它是天然雌激素17β-雌二醇的合成酯,20世纪50年代,E2V就已投入临床应用,目前已成为临床上最常用的雌二醇制剂。E2V主要应用于治疗雌激素低下性疾病、月经紊乱以及子宫内膜损伤性疾病,如卵巢早衰、围绝经期综合征、月经不调及IUA等。本研究就是应用E2V作为治疗IUA的辅助治疗药物,观察其治疗效果。雌激素受体(estrogen receptors, ERs)是一组广泛表达于细胞内外的蛋白质,它可以特异性的结合雌激素,使其被激活并转移至细胞核内,作用于相应的DNA片段,发挥生物学效应。也有最新研究证实ERs可以不通过与DNA结合而独立发挥生物学效应。ERs可以分为两种类型：核雌激素受体(属于细胞核内受体家族)和膜雌激素受体(属于G蛋白偶联受体家族)。核雌激素受体又分为ER-α和ER-β,其中人类编码ER-a的基因位于染色体6q24-q27上。因为ER-α常见表达于子宫内膜组织中,而ER-β则更广泛的表达于卵巢、大脑、骨骼等组织中,因此本实验主要探讨ER-α与宫腔粘连疾病的关系。现有的研究结果显示ER-α在肝纤维化、心肌纤维化等纤维化性疾病中与纤维化程度呈负相关关系,即ER-α高表达则纤维化程度减轻,反之则加重,说明ER-α对器官纤维化性疾病具有保护性作用。在子宫组织中,雌激素通过ER-α的介导,作用于子宫内膜功能层,促进子宫内膜腺体及间质的增生和修复,ER-α在子宫内膜中特有的生理作用让其成为了潜在的IUA治疗靶点。然而ER-α在IUA发生发展中的作用研究尚不深入,国外文献鲜有报道,为数不多的国内研究结果也存在极大的争议。有研究结果表明IUA程度与子宫内膜ER-a表达水平呈负相关关系,ER-α表达水平高的IUA患者预后较好；也有研究结果截然相反,提示IUA程度与ER-a的表达水平呈正相关关系,异常高表达的ER-a可以加重IUA程度。转化生长因子-β (TGF-β)是一种多效能细胞生长因子,它发挥生物学作用前的信息转导主要通过Smad蛋白家族完成。目前的研究结果证实在哺乳动物中常见的是TGF-β1、2、3,人类编码该细胞因子的基因位于染色体19q13上。这其中TGF-β1来源广泛,有众多细胞能分泌TGF-β1,它的基因多态性使其具有多样的生物学作用,如促进器官纤维化、保护神经、调节免疫应答、调节细胞周期等。国内外大量研究结果显示,TGF-β1在调节细胞外基质平衡的过程中,增加了胶原蛋白、糖蛋白等的合成和表达,与此同时减少了基质降解蛋白酶的合成,使TGF-β1成为了强效的促纤维化因子,在各器官纤维化性疾病中发挥着重要作用。TGF-β1在IUA中的研究也相当广泛,被公认为是导致IUA的重要细胞因子之一,研究结果显示子宫内膜TGF-β1表达水平与IUA程度呈正相关关系,重度IUA患者子宫内膜TGF-β1表达水平显著高于轻中度IUA患者。基质金属蛋白酶类(MMPs)家族是一组需要金属元素来催化的蛋白酶,分布广泛,可由众多细胞以非活性状态合成,由胞外蛋白酶裂解激活后,对细胞外基质成分如胶原蛋白IV、V发挥降解作用,减少细胞外基质的堆积。因此MMPs的生理作用与TGF-β相反,是一种分解细胞外基质的蛋白酶,可以降解已形成的纤维化组织。在器官纤维化性疾病中,MMPs是研究最为广泛的纤维化降解因子,在肝、肺、胰腺等众多纤维化性疾病中都证实了其对器官的保护作用。MMP9是MMPs家族的成员之一,人类编码该细胞因子的基因位于染色体20：46.01-46.02Mb上。目前有研究提示IUA患者子宫内膜组织中MMP9的表达明显低于正常对照组,而且其表达水平与IUA程度呈负相关。反之,上调MMP9可以促进细胞外基质降解,则有望减轻甚至逆转器官纤维化。研究显示,雌激素降低IUA患者子宫内膜纤维化的同时也可以显著上调子宫内膜组织中的MMP9表达。我们团队的前期研究也发现雌激素可以上调大鼠子宫内膜损伤后MMP9的表达和抑制IUA形成。为此,本研究采用机械和感染双重损伤法构建SD大鼠IUA动物模型,再予以不同剂量的E2V在不同时期应用于IUA大鼠模型,通过检测血清E2浓度、观察子宫内膜纤维化面积比、子宫内膜腺体计数、子宫内膜TGF-β1、MMP-9及ER-a的表达等一系列变化,评估雌激素对IUA的预防及治疗效果,以期更进一步的指导临床试验及临床应用。二、实验方法1.实验分组：将48只8-10周龄成年雌性SD大鼠随机分为8个组,每组6只大鼠(大鼠为“Y”字型双子宫,每组共12个子宫)。实验分组如下：(1)空白对照组：不构建宫腔粘连模型,不行E2V灌胃,仅灌胃生理盐水作为对照。(2)实验对照组：构建宫腔粘连模型,造模后不行E2V灌胃,仅灌胃生理盐水作为对照。(3)低剂量雌激素A组(低雌A组)、中剂量雌激素A组(中雌A组)、高剂量雌激素A组(高雌A组)：这3个雌激素组在行宫腔粘连造模后当天开始行E2V灌胃处理,灌胃剂量分别为0.206mg/(kg·d)、0.514mg/(kg·d)、1.028mg/(kg·d)。(4)低剂量雌激素B组(低雌B组)、中剂量雌激素B组(中雌B组)、高剂量雌激素B组(高雌B组)：这3个雌激素组在行宫腔粘连造模后第9d开始E2V灌胃处理,灌胃剂量分别为0.206mg/(kg·d)、0.514mg/(kg·d)、 1.028mg/(kg·d)。2.构建大鼠宫腔粘连模型：造模方法采用刮宫加感染双重损伤法,将10号医用无菌手术线浸泡于6mg/L的脂多糖生理盐水中,4℃放置24h备用。大鼠麻醉方法采用10%水合氯醛0.35ml/100g大鼠腹腔注射,麻醉成功后,严格无菌操作,切开大鼠下腹部,暴露大鼠子宫,于宫颈上方约5mm处作纵行切口,长度约4mm,采用自制大鼠宫腔刮勺经宫颈上方切口对大鼠行刮宫术,待宫腔四壁出现粗糙感时停止刮宫。将制作好的脂多糖棉线置入已行刮宫术的宫腔,在腹壁留一定长度的尾丝以便下一步取出棉线。生理盐水冲洗腹腔,缝合大鼠腹壁。24h后取出脂多糖棉线,9d后即可形成稳定的大鼠宫腔粘连模型。3.雌激素的剂量换算：E2V的灌胃剂量按照动物实验等效剂量换算法换算,低、中、高3种E2V的灌胃剂量分别为0.206mg/(kg·d)、0.514mg/(kg·d)、1.028mg/(kg-d),分别相当于60kg成年女性的E2V口服剂量2mg/d、5mg/d、10mg/d。人TCRA术后补充雌激素的持续时间通常为3-6个生理周期,因为大鼠的生理周期约为4-6 d,所以造模后当天和造模后9d给予E2V灌胃的时间均选择持续24d,约为大鼠生理周期的4～-6个周期。4.实验流程：造模前对所有大鼠剪尾采血。空白对照组、实验对照组和3个雌激素A组于实验第24d再次剪尾采血,并处死实验动物,收集双侧子宫组织；3个雌激素B组于造模第9d开始灌胃,同样灌胃24d后(即实验第33d)再次剪尾采血,并处死实验动物,收集双侧子宫组织。采集的血液样本采用ELISA法检测大鼠血清E2浓度,收集的大鼠子宫组织进行HE染色计数大鼠子宫内膜腺体数量、Masson染色计算大鼠子宫内膜纤维化面积比、免疫组化法检测子宫内膜TGF-β1、 MMP-9、ER-a的表达水平。三、统计分析采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析,所有实验数据均用均数±标准差表示,多组间整体比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),各组间两两比较：①符合方差齐性,则采用LSD方法检验；②若不符合方差齐性,则采用Tamhane’s T3检验。两组间的均值比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。四、实验结果1.各组大鼠血清雌二醇(E2)浓度结果(1)IUA造模前各组大鼠血清E2浓度比较于IUA造模前剪尾采血测定每组大鼠血清E2浓度,结果显示：比较8组大鼠血清E2浓度无显著性差异(F=0.752,P=0.643),说明造模前各组大鼠内分泌状况相近。(2)各组大鼠第二次采血血清E2浓度与第一次采血自身浓度比较空白对照组和实验对照组未予灌胃,24d后再次测定血清E2浓度与造模前比较无显著性差异(P空白对照组=0.295,P实验对照组=0.952)；3个雌激素A组于造模当天开始连续灌胃E2V 24d后,测定各组大鼠血清E2浓度,与造模前自身的浓度比较均显著升高(P<0.05),各组P值在P=0.002～0.000间,差异明显；3个雌激素B组造模后第9d开始灌胃雌激素,同样持续24d,抽血测定各组大鼠血清E2浓度,与造模前自身的浓度比较亦均显著升高(P<0.05),各组P值在P=0.002～0.000间,差异亦明显。(3)各组大鼠第二次采血血清E2浓度组间分别比较空白对照组与实验对照组比较,血清E2浓度无显著性差异(P=0.240)；6个雌激素组分别与2个对照组比较,血清E2浓度显著升高,均有显著性差异(P<0.05),P值均为0.000。3个雌激素A组间分别比较,随着灌胃E2V剂量的增加,血清E2浓度亦增加,结果具有显著性差异(P<0.05),中雌A组高于低雌A组,高雌A组高于中雌A组及低雌A组(P值均为0.000)。3个雌激素B组间分别比较,随着灌胃E2V剂量的增加,血清E2浓度亦增加,结果亦有显著性差异衅0.05),中雌B组高于低雌B组,高雌B组高于中雌B组及低雌B组(P值均为0.000)。灌胃相同剂量E2V的各组大鼠组间比较,低雌A组与低雌B组比较、中雌A组与中雌B组比较、高雌A组与高雌B组比较均无显著性差异,P值分别为P=0.656、P=0.189、P=0.721。(4)各组大鼠血清E2检测结果总结灌胃E2V后各组大鼠血清E2浓度的结果比较显示,各组大鼠血清E2浓度与雌激素灌胃剂量呈正相关关系。2.各组大鼠子宫内膜纤维化面积比结果：(1)经过造模处理的各组大鼠子宫内膜纤维化面积比与空白对照组喽较与空白对照组相比,经过IUA造模处理的另7组大鼠子宫内膜纤维化面积比显著升高,有显著性差异(P<0.05),各组比较的P值分别为：P实验对照组=0.001,P低雌A组=0.000,P中雌A组=0.043,P高雌A组=0.006,P低雌B组=0.000,P中雌B组=0.039,P高雌B组=0.025。(2)6个雌激素组子宫内膜纤维化面积比与实验对照组比较3个雌激素A组的纤维化面积比较实验对照组降低,有显著性差异(P<0.05),各组比较的P值分别为：P低雌A组=0.013,P中雌A组=0.021,P高雎A组=0.003。3个雌激素B组的纤维化面积比与实验对照组比较无显著性差异,各组比较的P值均为P=I.000。(3)6个雌激素组大鼠子宫内膜纤维化面积比的组间比较3个雌激素A组的组间比较,中雌A组和高雌A组比低雌A组的子宫内膜纤维化面积比降低,有显著性差异(P<0.05),P值分别为：P中雌A组=0.022,P商雌A组=0.008；中雌A组与高雌A组的纤维化面积比差异无显著性,P=0.988。3个雌激素B组的组间比较,大鼠子宫内膜纤维化面积比差异无显著性,分别比较的P值均为P=I.000。(4)各组大鼠子宫内膜纤维化面积比结果总结3个雌激素A组IUA大鼠的子宫内膜纤维化面积比降低,中雌A组和高雌A组低于低雌A组,而中雌A组和高雌A组比较无差异。3个雌激素B组IUA大鼠的子宫内膜纤维化面积比无改善,组间比较亦无差异。3.各组大鼠子宫内膜腺体计数结果(1)各造模组大鼠子宫内膜腺体计数与空白对照组比较与空白对照组相比,行IUA造模的7组大鼠子宫内膜腺体计数均显著减少,P值均为0.000。(2)各雌激素组大鼠子宫内膜腺体计数与实验对照组比较与实验对照组相比,3个雌激素A组大鼠的子宫内膜腺体计数增多,差异有显著性(P<0.05),P值均为0.000；3个雌激素B组大鼠的子宫内膜腺体计数与实验对照组比较无显著性差异(P>0.05),P值分别为：P低雌B组=0.536,P中雌B组=0.536,P高雌B组=1.000。(3)各雌激素组大鼠子宫内膜腺体计数的组间比较3个雌激素A组两两比较,中雌A组和高雌A组大鼠子宫内膜腺体计数比低雌A组增多,差异有显著性(P<0.05),P值分别为：P中雌A组=0.002,P高雌A组=0.022；中雌A组和高雌A组比较无显著性差异(P>0.05),P=0.224。3个雌激素B组两两比较,中雌B组和高雌B组的子宫内膜腺体计数与低雌B组比较差异无显著性,P值分别为P中雌B组=0.224、P高雌B组=0.536；中雌B组和高雌B组比较两组亦无显著性差异,P=0.536。(4)各组大鼠子宫内膜腺体计数结果总结3个雌激素A组的IUA大鼠子宫内膜腺体计数增加,中雌A组和高雌A组腺体计数多于低雌A组,而中雌A组和高雌A组间比较无差异。3个雌激素B组的IUA大鼠子宫内膜腺体计数无改善,组间比较亦无差异。4.各组大鼠子宫内膜TGF-β1表达结果(1)各造模组大鼠子宫内膜TGF-β1表达水平与空白对照组比较与空白对照组相比,7个行IUA造模组的大鼠子宫内膜TGF-β1的表达水平明显升高,差异有显著性(P<0.05),P值均为0.000。(2)各雌激素组的大鼠子宫内膜TGF-β1表达水平与实验对照组比较6个雌激素组的大鼠子宫内膜TGF-β1的表达水平较实验对照组明显降低,差异有显著性(P<0.05),P值均为0.000。(3)各雌激素组大鼠子宫内膜TGF-β1表达水平的组间比较3个雌激素A组组间比较,中雌A组和高雌A组的子宫内膜TGF-β1表达量比低雌A组明显降低,差异有显著性(P<0.05),P值分别为：0.003及0.002；中雌A组与高雌A组相比结果无显著性差异(P=0.842)。3个雌激素B组组间比较,中雌B组和高雌B组的子宫内膜TGF-β1表达量与低雌B组相比明显降低,差异有显著性(P<0.05),P值分别为：0.001及0.002；中雌B组和高雌B组比较结果无显著性差异(P=0.918)。灌胃相同剂量的雌激素组组间比较,低雌A组与低雌B组、中雌A组与中雌B组、高雌A组与高雌B组的子宫内膜TGF-β1表达结果均无显著性差异,P值分别为：P低雄=0.747、P中雌=0.984、P高雌=0.778。(4)各组大鼠子宫内膜TGF-β1表达结果总结6个雌激素组的IUA大鼠子宫内膜TGF-β1表达水平均降低,中剂量和高剂量雌激素组表达水平均低于低剂量组,而高剂量组和中剂量组的TGF-β1表达水平无差异。5.各组大鼠子宫内膜MMP9表达结果(1)各造模组大鼠子宫内膜MMP9表达水平与空白对照组比较空白对照组与实验对照组子宫内膜MMP9表达水平无显著性差异(P=0.672)；其余6个雌激素组的大鼠子宫内膜MMP9表达水平比空白对照组明显升高,有显著性差异(P<0.05),P值均为0.000。(2)各雌激素组大鼠子宫内膜MMP9表达水平与实验对照组比较与实验对照组相比,6个雌激素组的大鼠子宫内膜MMP9表达水平明显升高,有显著性差异(P<0.05),P值均为0.000。(3)各雌激素组大鼠子宫内膜MMP9表达水平的组间比较3个雌激素A组组间比较,中雌A组和高雌A组的子宫内膜MMP9表达水平比低雌A组升高,差异有显著性(P<0.05), P值均为0.000；中雌A组和高雌A组比较结果无显著性差异(P=0.379)。3个雌激素B组组间比较,中雌B组和高雌B组的子宫内膜MMP9表达水平与低雌B组相比显著升高(P<0.05),P值均为0.000；中雌B组和高雌B组的结果比较无显著性差异(P=0.550)。灌胃相同剂量的雌激素组组间比较,低雌A组与低雌B组、中雌A组与中雌B组、高雌A组与高雌B组的子宫内膜MMP9表达结果均无显著性差异,P值分别为：P低雄=0.893、P中雌=0.421及P高雌=0.279。(4)各组大鼠子宫内膜MMP9表达水平总结6个雌激素组IUA大鼠的子宫内膜MMP9表达水平均升高,中剂量和高剂量雌激素组表达水平均高于低剂量组,而高剂量组和中剂量组的MMP9表达水平无差异。6.各组大鼠子宫内膜ER-a表达结果(1)各造模组大鼠子宫内膜ER-a表达水平与空白对照组比较与空白对照组相比,7个行IUA造模组的大鼠子宫内膜ER-a表达水平明显降低,P值均为0.000。(2)各雌激素组大鼠子宫内膜ER-a表达水平与实验对照组比较6个雌激素组的大鼠子宫内膜ER-a表达水平较实验对照组明显升高,差异有显著性(P<0.05),P值均为0.000。(3)各雌激素组大鼠子宫内膜ER-a表达水平的组间比较3个雌激素A组组间比较,中雌A组和高雌A组的大鼠子宫内膜ER-a表达水平比低雌A组显著升高(P<0.05), P值均为0.000；中雌A组和高雌A组间比较无显著性差异(P=0.513)。3个雌激素B组组间比较,中雌B组和高雌B组的内膜ER-a表达水平较低雌B组显著升高(P<0.05),P值均为0.000；中雌B组和高雌B组比较无显著性差异(P=0.536)。灌胃相同剂量的雌激素组组问比较,低雌A组与低雌B组、中雌A组与中雌B组、高雌A组与高雌B组的子宫内膜ER-a表达水平均无显著性差异,P值分别为：P-=0.359、P中雌=0.378及P高雌=0.359。(4)各组大鼠子宫内膜ER-a表达水平总结6个雌激素组IUA大鼠子宫内膜ER-a表达水平均有升高,中剂量和高剂量雌激素组的表达水平均高于低剂量组,而高剂量组和中剂量组的ER-α表达水平无差异。五、结论1.3个雌激素A组经E2治疗后纤维化面积比较实验对照组降低,腺体计数相对增多,考虑是否与在宫腔创伤初期IUA尚未完全形成时就开始服用雌激素,对大鼠IUA具有一定的预防作用有关；3个雌激素B组纤维化面积和腺体计数均无明显改善,可能与宫腔创伤后期、粘连程度加重、应用雌激素的时间拖后,治疗效果欠佳有关,考虑在这个阶段不能单一应用雌激素治疗IUA,如能结合TCRA、宫内隔膜、干细胞等综合性治疗应该会增加疗效。2.雌激素组中,中、高剂量组的TGF-β1表达水平较低剂量组降低,MMP9表达水平则升高,而中、高组间比较无差异,说明TCRA术后应用中剂量雌激素是最低的有效剂量。3.中、高剂量雌激素组的ER-α表达水平较低剂量雌激素组高,说明雌激素可以诱导ER-α的合成,而中、高剂量组间无差异,说明ER-α的合成并不完全与雌激素剂量相关,需要进一步的基础研究探讨ER-α的表达机制。