研究背景Glioblastoma(GBM)是成年人最常见的脑部肿瘤,美国每年将近有16,800新诊断的脑部肿瘤,其中60%是GBM；最近的研究表明：患者1年生存率17.7%,2年生存率约为3.3%,3年以上的生存率约为1.8%-2.2%,平均中位生存率大概是8-12个月,尽管如此,在过去的20年里,在GBM治疗方法上基本没有进展,目前认为,在较彻底的外科手术切除病灶后,结合放射治疗比单独只接受外科手术的疗效好,也是目前GBM治疗的主要手段,而只进行放射治疗不接受外科手术,治疗效果也较差,容易原位复发,同时由于GBM的多型性使预后十分不乐观；因而寻找GBM有效的治疗手段,是目前医学界的一个难题,而伊马替尼(Imatinib, STI571, Glivec,Gleevec)的出现为GBM的治疗带来了一线曙光。Imatinib是一个小分子的靶向酪氨酸激酶抑制剂,它有三个主要的作用靶点,其中PDGFR的酪氨酸激酶是其作用靶点之一。PDGF和PDGFR在胶质瘤是过度表达的,并且在胶质瘤的信号转导过程中扮演了重要的角色；临床前研究表明,Imatinib通过抑制仅在胶质瘤细胞中才被高度激活PDGF/PDGFR自分泌环,使Rad51的表达降低,增加了胶质瘤细胞对放射的敏感性,从而可达到增强治疗GBM疗效的目的,综上所述,这些证据都预示着Imatinib可能是治疗GBM的很有希望的一个药物,然而临床试验结果却是令人失望的,Imatinib治疗胶质瘤的效果微乎其微。人们推测原因之一很可能是由于ABC转运蛋白的存在,使到达靶细胞的浓度太低了,无法达到治疗效果。胶质瘤细胞上ABC转运蛋白相关的多药耐药基因的表达如何?Imatinib是否诱导相关基因和相关蛋白的表达?哪种ABC转运蛋白在胶质瘤细胞转运Imatinib的过程中起了主要的作用?如何能增强Imatinib对胶质瘤的疗效?本文围绕上述问题展开研究。研究目的1.研究Imatinib对C6胶质瘤细胞的生长、凋亡、细胞周期的影响；2.研究Imatinib对C6胶质瘤细胞膜上ABC转运蛋白相关基因和相关蛋白的表达的影响；3.观察Imatinib与主要的ABC转运蛋白之一的P-糖蛋白抑制剂valspodar联合给药后,Imatinib对C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用的影响以及细胞内Imatinib含量的变化,来研究P-糖蛋白在C6胶质瘤细胞转运Imatinib过程中的作用。4.观察P-糖蛋白表达水平降低后,Imatinib对C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用的影响,进一步研究P-糖蛋白在C6胶质瘤细胞转运Imatinib过程中的作用。研究方法1. Imatinib对大鼠C6细胞的增殖抑制作用(1)研究大鼠C6细胞的生长曲线常规培养C6细胞,传代,分别于24、48、72、96、120、144和168小时,台盼兰拒染活细胞计数法测定细胞生长情况,绘制细胞生长曲线；(2)研究Imatinib处理前后C6细胞形态学的变化常规培养C6细胞,置于倒置显微镜下观察细胞的形状、大小、生长状态等；(3)研究Imatinib对C6细胞的生长抑制作用常规培养C6细胞,实验时将细胞分为9个浓度组,分别为对照组、0.039μM、0.078μM、0.156μM、5μM、10μM、15μM、17.5μM和20μM组,分别于作用24h、48h、72h和96h用MTT法检测细胞生长抑制率；(4)研究Imatinib处理C6细胞不同时间的IC50常规培养C6细胞,实验时将细胞分为4个时间组,分别为24h、48h、72h和96h,每个时间组下设9个浓度组,分别为对照组、0.039μM、0.078μM、0.156μM、5μM、10μM、15μM、17.5μM和20μM组,测定各时间点下的IC50；(5)研究Imatinib对C6细胞的凋亡诱导作用和对细胞周期的影响常规培养C6细胞,实验时将细胞分为4组,分别为对照组、0.156gM组、10μM组和15μM组,对照组不加药物。Hoechst 33342/PI染色、Annexin V-FITC/PI双染法、流式细胞仪检测细胞凋亡以及细胞周期分布情况。2.C6细胞ABC转运蛋白相关基因的表达及改变常规培养大鼠C6细胞,实验时将细胞按Imatinib处理浓度分为4组,分别为对照组、低浓度(0.156μM)组、中浓度(10μM)组和高浓度(15μM)组,各浓度组下设3个时间点,分别为24h、48h和72h；用实时荧光定量PCR法分别检测C6细胞上mdr1a、mdr1b、mrp1、mrp4和bcrp等基因的表达情况,以及Imatinib处理C6细胞后,上述基因表达的变化情况。3. Imatinib与P-gp抑制剂valspodar联合给药后,对C6细胞的生长抑制作用常规培养大鼠C6细胞,实验时将细胞分为对照组、Imatinib组、valspodar组和Imatinib+valspodar组；其中对照组不加任何药物,Imatinib+valspodar组在加入valspodar30min后加入Imatinib。加药后作用72h,MTT法检测各组的细胞生长抑制率。4. Imatinib与P-gp抑制剂valspodar联合给药前后,C6细胞内Imatinib含量的变化常规培养大鼠C6细胞,实验时将细胞分为2组,分别为Imatinib组和Imatinib+valspodar组；其中Imatinib组Imatinib的浓度为1μM, Imatinib+valspodar组中Imatinib的终浓度为1μM, valspodar的终浓度为0.5μM；每组的细胞各培养3瓶,用LC-MS-MS法测定Imatinib联合valspodar前后,细胞内Imatinib的含量。5. Mdrlb基因干扰后,Imatinib对C6细胞的增殖抑制作用常规培养大鼠C6细胞,实验时将细胞按Imatinib浓度分为8组,分别为对照组、0.156μM、10μM、15μM、干扰对照组、干扰后0.156μM、干扰后10μM和干扰后15μM组,其中对照组不加任何药物,干扰对照组只加lipo2000脂质体和非特异性siRNA。RT-qpcr和western blot分别检测RNA干扰后,mdrlb基因和P-糖蛋白的表达水平；MTT法检测各组细胞的生长抑制率。6.统计学方法实验结果以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS13.0软件进行统计学处理。若只有一种影响因素则采用单因素方差分析(one-way ANOVA);两种因素以上采用析因分析,有交互效应时进行单因素效应分析,无交互效应时,每种因素可采用单因素方差分析；多重比较若方差齐采用LSD法,方差不齐时采用近似F检验(Welch方法)及多重比较的Dunnett’s T3方法；两组间均数比较采用独立样本t检验分析；P<0.05(双侧)表示差异有显著性。研究结果1. Imatinib对大鼠C6细胞的增殖抑制作用(1)倒置显微镜下观察,C6呈梭型,细胞体积较小,细胞贴壁良好,；细胞计数法绘制细胞生长曲线可见,第2-4天C6细胞呈对数生长期；第7天与前一天比较细胞数略微减少,呈平台期。(2)各浓度Imatinib处理C6细胞后,随着药物浓度的增加,细胞数目逐渐减少,细胞由梭形逐渐收缩变圆,细胞间失去彼此连接；C6细胞的生长曲线出现明显变化,各时间点下随着Imatinib作用浓度的升高,活细胞数减少,OD值逐渐降低,曲线逐渐变为低平状态。(3) Imatinib处理C6细胞24h、48h、72h和96h后,显示各浓度Imatinib对C6细胞均有生长抑制作用,且呈明显的时间-浓度依赖性。(4) Imatinib处理C6细胞24h、48h、72h和96h后,其抑制C6胶质瘤细胞生长的IC50分别为：26.10μM、21.46μM、13.32μM和11.84μM,随着药物作用时间的延长,IC50逐渐降低。(5)各时间点各浓度组细胞的凋亡率与对照组相比均有显著性差异(P<0.01),且呈时间和浓度依赖性；流式细胞术检测细胞周期结果显示,各浓度组细胞的G1/G0期细胞与对照组相比显著增多(P<0.01)；G2期和S期细胞与对照组相比显著减少(P<0.05或P<0.01),显示细胞在G0/G1期出现阻滞。2. Imatinib对ABC转运蛋白相关基因和相关蛋白的影响(1)荧光定量PCR检测结果显示,各基因的表达量为：mdr1b>mdr1a>mrp4>mrp1 >bcrp; mdr1b的表达量最高,mdr1a的表达量约为mdrlb的90%,mrp4、mrp1的表达量分别约为mdrlb的20%和10%,而bcrp的表达量较低,几乎检测不到。(2)在不同的药物浓度和不同的药物作用时间下,各基因均出现了明显的上调(P<0.05或P<0.01),其中上调倍数最高的是在10μM Imatinib作用24h后,mrp4基因上调了约6倍。(3) Imatinib 10μM作用72h后,p-gp和mrp4蛋白表达水平均升高,且与对照组相比,有显著差异(P<0.05)。3. Imatinib与P-gp抑制剂valspodar联合给药对C6细胞的增殖抑制作用的影响(1) Imatinib0.5μM组内,ima0.5μM+va10.5μM组、ima0.5μM+vallμM组和ima0.5μM+val2μM组与对照组Imatinib0.5μM组相比,Imatinib对C6细胞的抑制率均显著增加(P值均为0.000)。(2) Imatinib1μM组内,ima1μM+val0.5μM组、imal1μM+val1μM组、ima1μM +val2μM组与对照组Imatinib1μM组相比,Imatinib对C6细胞的抑制率均显著增加(P值均为0.000)。(3) Imatinib5μM组内,ima5μM+val0.5μM组、ima5μM+val1μM组和ima5μM +val2μM组与对照组Imatinib5μM组相比,Imatinib对C6细胞的抑制率均未见明显改变(P=0.637,P=0.519和P=0.133)。综上所述,当Imatinib在较低浓度(0.5μM和1μM)下与P-gp抑制剂valspodar联用时,可显著增加Imatinib对C6细胞的抑制率,而当Imatinib浓度增加至5μM时,这种作用并不明显；4. Imatinib与P-gp抑制剂valspodar联合给药对C6细胞内Imatinib含量的影响(1)采用LC-MS-MS测定细胞内Imatinib的含量,在0.4506-450.6ng/ml范围内成良好线性关系,其标准曲线为y=0.02155x+0.0007232(r=0.9980)。细胞内液中的内源性物质不干扰Imatinib的测定,表明专属性良好。制备浓度为4.506,45.06和225.03ng/ml的细胞内液样本,各样本相对回收率为103.31%±9.69%,98.920%±7.37%和100.051±8.96%；制备浓度为4.506,45.06和450.06ng/ml的细胞内液样本,日内精密度的RSD分别为8.86%,5.99%和4.35%(n=6)；日间精密度的RSD分别为7.69%,6.16%和5.58%,表明精密度良好。在3次反复冻融实验中,未发现明显的降解；样本储存在-20℃,4个月内未发现明显的降解；室温下,至少在72h内样品在细胞提取液中的稳定性好,此过程中未发现药物的降解；按信噪比(S/N)>3计算,检测限为0.1ng/ml。(2) Imatinib与P-gp抑制剂valspodar联用后,每1×105个细胞内Imatinib含量为3.19±0.73ng与联用前1.40±0.46 ng相比,显著增多(P=0.023)。5.Mdr1b基因干扰后,对C6细胞的增殖抑制作用的影响(1)RNA干扰后对mdrlb基因mRNA表达的抑制作用靶向siRNA mdr1b转染C6细胞24h后,siRNA mdr1b-253mRNA相对表达量为18.53%±1.53%,与空白对照组比较,siRNA明显下调mdr1b mRNA的表达(t=92.601, P=0.000); siRNA mdrlb-1877 mRNA相对表达量为73.67%±42.22%,siRNA mdrlb-1973 mRNA相对表达量为105.33%±40.92%,与空白对照组比较,mdr1b mRNA的表达均无显著差异,因而选择siRNA mdr1b-253作为实验的干扰序列。siRNA阴性对照的mRNA相对表达量为80.67%±28.43%,与空白对照组比较mdrlb mRNA的表达水平无明显变化。(3) Mdrlb基因干扰后对p-gP蛋白表达的变化靶向siRNA mdr1b转染C6细胞72h后,与对照组相比,p-gp的表达量比干扰前显著降低(P<0.05)。(4) siRNA mdrlb联合Imatinib后对C6细胞增殖抑制的影响MTT结果显示,不同浓度Imatinib作用于转染siRNA mdrlb的C6细胞,随浓度的增加细胞生长的抑制作用明显增强；作用72h后,Imatinib组(0.156μM、10μM和15μM)的抑制率分别为0.45%±0.12%,36.37%±6.95%和40.03%±2.84%,而siRNA mdrlb+Imatinib联合组(0.156μM、10μM和15μM)的抑制率分别为6.52%±0.82%,52.21%±4.47%和53.72%±4.22%,因此siRNA mdr1b干扰后Imatinib对C6细胞的抑制率比干扰前显著提高,且有显著性差异(t=16.734,P=0.000; t=4.286,P=0.003; t=6.012,P=0.000)。结论1.本实验首次报道Imatinib可抑制C6胶质瘤细胞的生长,且具有时间-浓度依赖性但IC50较高；2. Imatinib抑制C6胶质瘤细胞的生长的机制是诱导细胞凋亡的发生,细胞凋亡率呈时间-浓度依赖性；同时Imatinib可使C6细胞在G0/G1期出现阻滞。3.本实验首次发现Imatinib可诱导ABC转运蛋白相关基因和相关蛋白的表达,介导了Imatinib对C6细胞的增殖抑制作用；4.P-gp抑制剂Valspodar与Imatinib联合给药后,明显增强Imatinib对C6细胞的增殖抑制作用,表明P-gp可介导C6细胞对Imatinib的不敏感性；5.RNA干扰使P-gp蛋白表达水平下调后,明显增强Imatinib对C6细胞的增殖抑制作用,进一步表明P-gp可介导C6细胞对Imatinib的不敏感性。